Summary
我々は存在する
Abstract
膜融合は、細胞内へのエンベロープウイルスの入力時に必須の工程である。従来の核融合アッセイは、通常、それは難しい関係する分子の手順のシーケンスを定量的に分析すること、核融合の多数のイベントを報告する。我々は本質的に流体のサポート上のターゲットの二重層を持つ単一のウイルス粒子の融着の速度を監視するためin vitroで、2色の蛍光アッセイを開発した。
インフルエンザウイルス粒子が細胞膜とウイルスの内部を染色する赤親水性の蛍光物質を染色する緑色の脂溶性蛍光体とインキュベートされています。我々は、フローセルのデキストラン- functionilizedガラスの表面にガングリオシドを含む脂質二重膜を堆積、CCD上の粒子の数百を含む、平面二重層と画像100 × 100μmの2領域の蛍光でウイルス粒子をインキュベートカメラ。イメージングの両方赤と緑の蛍光によって、我々は、同時に膜の色素（緑）と粒子の水性内容（赤）の動作を監視することができます。
融合のpH下の値にpHを下げる際に、粒子は、膜と融合するだろう。 Hemifusionは、標的膜の外葉とウイルス膜の外葉の融合、粒子の緑色蛍光の急激な変化として表示されます。残り2つの遠位リーフレットのその後の融合時に細孔が形成され、ウイルス粒子の赤色発光蛍光体は、標的膜の下にリリースされる予定です。このイベントは、個々の粒子の赤色蛍光の減少を生じさせるだろう。最後に、標的膜に埋め込まれているpH感受性蛍光体からの統合された蛍光はpHの低下の正確な時間を報告します。
three蛍光時のトレースから、すべての重要なイベント（pHの低下、孔形成時に混合hemifusion、コンテンツに応じて混合脂質）は、現在直接的な方法で、個々にすべての粒子について、抽出することができます。ヒストグラムの多くの個々の粒子のための様々な遷移のために経過時間を収集することにより、我々は、対応する中間体の寿命を決定することができます。直接蛍光観察を持っていなくても隠された中間体は、これらのヒストグラムから直接可視化することができます。
Protocol
ガラスカバースリップの機能化
融合アッセイで使用される平面二重層は、デキストランの水和フィルムでサポートされています。デキストランは、平面二重層とガラス面との間のスペーサーとして機能します。これにより、ガラス表面に付着し、また、ウイルス粒子の内容が融合によって逃げることができるのでスペースを提供するになるから膜成分を防ぎます。ガラス製カバースリップは、ガラス（Elender、 ら、1996）に化学的に結合デキストランに私たちを可能にするシランエポキシ、治療によって官能化される。
- セラミック染色ラック25mmのカバーグラスを配置し、jarファイルまたはビーカーにラックを配置。
- 実験室グレードのガラス製品の洗浄剤の10％溶液と容器を埋める。 30分間超音波洗浄器に容器を置きます。
- 脱イオン水と容器とカバーグラスのラックをすすぎ、および1M postassium水酸化補充。別の30分間入浴の超音波処理するコンテナを返します。
- アセトンとエタノールを使用してこの洗浄手順を繰り返します。
- 水と乾燥でcoverlipsをすすぐ。
- 最後に、3分間の酸素プラズマのストリッパーとカバーグラスを清掃してください。
- 最後の洗浄ステップは、以下のシリル化のステップでガラスが均一に親水性と反応性作り、表面を酸化させる。
- イソプロパノールで3 -グリシドキシプロピルシランの0.2％溶液を調製します。 5分間この溶液中でカバーグラスを浸し。
- シラン液を捨て、イソプロパノールでカバーガラスを数回すすいでください。
- カバースリップは、現在シランの層でコーティングされていますが、ガラスへの共有結合にシランできるように硬化されている必要があります。 1時間80℃に設定したオーブン中でカバーグラスを置きます。
- カバーガラスが硬化している間、デキストラン500を計り、30％w / v溶液を準備。水を予熱すると溶解する際に役立ちます。我々は、カバースリップあたりこの溶液約1mlを使用します。デキストランが溶解した後、真空デシケーター内の溶液を泡を取り除く。
- シラン化カバースリップは、硬化が終了したら、セラミックラックから取り出して、プラスチック製の冷凍ボックスの内側に、それらは平らなアレンジ。デキストラン溶液の約1 mlを各カバーの上面をカバーするために1 mlのピペットを使用してください。フリーザーボックスを閉じ、24〜36時間のための静かな場所におきます。
- プラスチックピンセットでカバーグラスをつかんで、余分なデキストランを取り除き、セラミックラックにそれらを交換してください。水の中でカバーガラスを数回すすぎ、およびカバースリップは48時間水に浸漬することができます。瓶を静かにテーブルトップのローテーターで攪拌されることがあります。
- 80度摂氏と真空デシケーターのストアに設定したオーブン中でカバーグラスを乾燥させる。
リポソーム調製
サポートされている脂質二重層は、デキストラン、官能カバースリップにリポソームを吸着することによって形成される。吸着リポソームは、表面上に平坦な膜が破裂し、スプレッドまで、お互いに融合する。
- アッセイで使用される一般的なリポソーム製剤は、1,2 - 、ジオレオイル- sn -グリセロ-3 -ホスホコリン（DOPC）、1 -オレオイル-2 -パルミトイル- sn -グリセロ-3 -ホスホコリン（POPC）、コレステロール、ウシ脳から構成されています4:4:2:0.1:5 × 10 -5の比で1,2 - dihexadecanoyl - sn -グリセロ-3 -ホスホエタノールアミン- Disialoganglioside（GD 1A）、およびN -（（biotinoyl）アミノ）ヘキサノイル（6）。すべてのコンポーネントは、クロロホルムまたはクロロホルムとメタノールのソリューションに格納されています。
- ガラスの試験管に各成分の量を転送することにより、脂質二マイクロモルを含む液を調製する。アルゴンまたは窒素ガス気流下で溶媒を蒸発させる。 2時間真空デシケーター中で試験管を残すことによって、残りの溶剤を削除します。
- HNEのバッファ400マイクロリットル（5 mMのHEPES、145 mMのNaCl、0.1mMのEDTA）で乾燥脂質フィルムを再懸濁します。
- プラスチック製のマイクロ遠心チューブに懸濁液を移す。温水浴における液体窒素浴と融解の懸濁液を凍結する。この凍結/融解サイクルを4回繰り返します。
- 100nmのポリカーボネートメンブレンフィルターと脂質の押出機を組み立て、そして脂質の懸濁液を25回押し出します。サスペンションは、押出後さらに透明にする表示されます。
- リポソームは、彼らが準備されている日に使用する必要があります。使用されるまで、それらは室温で保存することができます。
マイクロ流体フローセルの準備
シンプルなマイクロフローセルは、石英のスライドと、官能カバーガラスの間にダブルスティックテープを挟むことにより行われます。
- 20x20x3ミリメートル石英スライドを入手。反対側にある2つ1ミリメートルの穴をドリルダイヤモンドバリを使用してください。
- ダブルスティックテープのシートから20mm角をカットし、カミソリの刃を使用して、中心から15 × 2 mmのセクションを切り取る。
- テープバッキングの片側をはがし、およびクォートするためにテープを付着zのスライド。官能化されたカバースリップに反対側に付着する。
- ポリエチレンチューブの2本の20 cmの長さをカットし、石英スライドの穴に挿入してください。
- 5分エポキシ接着剤でフローセルを密封する。
- バッファを持つ接着剤が硬化した、プライムフローセルとチューブ。
- サポートされている脂質二重層は、チャネルにリポソーム懸濁液の約80マイクロリットルを描画することで、この段階で形成することができる。
ウイルス粒子のラベリング
- H3N2インフルエンザAは、（X - 31）一般的に融合アッセイに使用されますが、他のインフルエンザ株と他のウイルスが正常に使用されている。
- ウイルスはhemifusionと細孔形成の検出を可能にするために二つの異なる蛍光色素にしてまでラベルが付いています。
- 20mMのソリューションを作成するHNEバッファにスルホローダミンB（SRB）を溶かす。ウイルス懸濁液10マイクロリットルで色素溶液の20マイクロリットルを組み合わせ、20時間室温でおきます。この期間中に、色素は徐々にウイルス粒子内に蓄積されます。
- PD - 10脱塩カラムを介してウイルス懸濁液を渡すことによって、余分な染料を外します。十分なウイルス材料が使用されている場合は、着色されたバンドは、列で見ることができます。このバンドは、ラベル付けされたウイルスが含まれており、それが溶出されるように収集することができる。
- ないバンドが表示されない場合は、200マイクロリットルのフラクションを収集し、分画は分光光度計で565 nmの吸収を測定することにより、ラベルの付いたウイルスが含まれているかを判定する。ウイルスは、約0.8 mlの全体積に溶出してください。
- SRBというラベルのウイルス懸濁液にオクタデシルローダミン110（Rh110C18）の2 mMのジメチルホルムアミド（DMF）溶液を13マイクロリットルを添加することによりウイルスのエンベロープにラベルを付けます。
- 実験室のローテータにチューブを接続することによってサスペンションをかき混ぜると、3時間放置する。
- 前に説明したように、PD - 10脱塩カラムを用いて過剰Rh110C18からウイルスを精製する。
顕微鏡の構成
実験は、全内部反射蛍光顕微鏡に適した高NA油浸対物レンズを装備した蛍光顕微鏡上で実行されます。アルゴン/クリプトンガスレーザーから488と568 nmのラインはRh110C18とSRBというラベルの付いたウイルスを励起するために使用されます。各ラベルの同時イメージングは、分割するダイクロイックミラーと、緑色と赤色の蛍光発光することで実現し、独立して電子乗じてCCDカメラの別の半分に画像を注力しています。
アッセイを行う
塗装、ラベルの付いたウイルス粒子のドッキング、フルオレセインとの表面、および低pH緩衝液（図1A）との反応の開始を平面脂質二重膜の組立：融合アッセイの実行は、フローセル内の生化学的成分の段階的な組み立てを含む。
- 顕微鏡のステージにフローセルをマウントし、毎分40マイクロリットルの速度で流れるように設定されたシリンジポンプにアウトレットチューブを取り付けます。
- HNEの300マイクロリットルで流すことにより過剰なリポソームの流路をクリアします。
- 顕微鏡の焦点と488nmの光と568 nmの光の70 W / cm 2の350 W / cm 2の表面を照らすためにレーザーパワーを調整する。あなたが1.45 NA 60倍油浸対物レンズを使用している場合は、それぞれ、100マイクロワットと20マイクロワットにレーザー強度を設定します。
- フローセルに標識ウイルスを（1 / 100に希釈）ポンプ。ウイルスは、流路の底部表面に拡散するように、粒子が脂質二重層に組み込まれているガングリオシドに固執して開始されます。
- ドッキングウイルス粒子の適切な密度（最大視野あたり約1000粒子に）達成されたとき。ミリリットルフルオレセイン標識されたストレプトアビジン当たり2マイクログラムを含む溶液にインレットチューブを切り替えます。標識ストレプトアビジンは、二重層に結合脂質分子をビオチンには結合され、最終的に薄暗い緑の背景が表示されます。
- HNEの300マイクロリットルと流路を洗浄してください。
- 、撮像領域を選択し、顕微鏡を集中し、時間経過した画像取得用CCDカメラを準備。 100ミリ秒に露光時間を設定し、10 Hzのレートでフレームを収集する。
- 10mMのクエン酸ナトリウムと140mMのNaClを含有する酸性緩衝液中で流れることによって融合を開始。バッファーのpHは、アッセイされるウイルスの臨界pH以下になるように調整されるべきである。 X - 31のpHでヒューズは、5.5の下にあります。
代表的な結果
図1Bは、融合の実行前と実行中二重層ドッキングビリオンのスナップショットを示しています。それぞれの回折限界のスポットは、個々のウイルス粒子を表しています。赤色と緑色の蛍光が別々にウイルスエンベロープとコンテンツラベルの同時観測が可能、CCDカメラの上半分と下半分上に結像されています。に比べて緑チャネルの2倍の多くのスポットが一般的にあります。赤、そしてこれは、封筒のラベルに比べてコンテンツの色素でラベリングの効率が低下を反映している。フルオレセインを結合した表面から放射される緑色のバックグラウンドの蛍光はクエン酸緩衝液の到着時に消滅し、核融合反応の開始時刻の決定を可能にする。 Hemifusionイベントはhemifusionの茎間のウイルスのエンベロープ拡散で急冷Rh110C18として緑色蛍光のバーストとして検出され、平面膜で希釈される。外に広げ蛍光雲が平面膜における脂肪酸-アシルリンクされている染料の自由拡散を示す、hemifused粒子の周りに見ることができます。細孔の形成は、ウイルス粒子の内部に閉じ込められたSRBからの赤色蛍光の減衰として観測される。融合細孔の開口部は色素が観察領域の平面脂質二重層と外下記の水性空間に脱出することができます。
各粒子の蛍光強度の軌跡は、hemifusionと細孔形成の収率と時間（図1C）の決定を容易に、個々の粒子の積分強度からプロット。 Hemifusionと孔形成イベントの時間は、Rh110C18蛍光バーストまたはSRBの信号の減衰の最大傾斜が発生する点として決定される。成功した実験では、Rh110C18降伏dequenching信号、およびSRBというラベルの粒子の30％で標識された粒子の約50％が使用可能なシグナルを与える。両方の色素で標識された粒子のうち、約10％は両方の脂質混合し、孔形成のシグナルを示しています。
図。 2A - Cは、典型的な実験からhemifusionと孔形成の遅れ時間の分布を示しています。 Fig.2D - Fは、同じ条件で5つの実験から結合イベントのイベントの分布を示しています。観測の控えめな数があっても、ヒストグラムの形状は明らかである。各実験はpHの低下の時間を検出することによって同期されるため、複数の実験を組み合わせることができ、中間のステップをレート制限に関する詳細な情報を得ることができます。
図1実験デザイン。 A）ウイルス粒子がhemifusionと融合孔形成の動態を監視するには、2つの蛍光色素で標識されています。蛍光は高NA顕微鏡対物によって収集され、CCD上に結像される。前（左）と中B）蛍光画像（右）個々のウイルス粒子の融合。各画像の上部と下半分は、サポートされている二重層の同約50 x 100 mmの2領域の、それぞれ、赤色と緑色蛍光に対応しています。 C）赤SRBバイラルコンテンツのトレーサーの蛍光強度（上側のトレース）、緑Rh110C18膜色素（真ん中のトレース）、およびフルオレセインのpHセンサは、（下のトレース）pHの低下、hemifusion、そして融合の間に経過した正確な時間を提供しています。してくださいここをクリックして図1の拡大バージョンを参照すること。
図2。蛍光標識ウイルスの融合動力学。 pHの低下とhemifusion（A、D）と細孔形成（B、E）の間の経過時間の分布。ディストリビューションの立ち上がりと減衰では、複数の中間ステップの存在を示している。 hemifusionと個々の粒子の融合細孔の開口部間の遷移は、指数関数的に単一の律速段階を示唆し、配布されています。パネルA〜Cは、単一の実験の結果を示す。パネルのDFは、同じ条件で実行5つの別々の実験からコンパイルされます。してくださいここをクリックして図2の拡大バージョンを参照すること。
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Discussion
流体と連続的なサポートされている脂質二分子膜の調製が困難な場合があります。材料や表面欠陥を汚染の微量の脂質二重層の拡散防止します。デキストランの均一な層を慎重に洗浄し、堆積が不可欠です。
ウイルス粒子の長時間のイメージングは、漂白剤蛍光ラベルをまたはそれらを不活化になることがあります。この種の光損傷はよくバイオイメージングおよび単一分子の分野で知られており、一般的に励起蛍光による活性酸素種の生成に由来すると考えられている。写真の損傷を最小限に抑えるために、我々は一般的に励起レーザパワーを最小化し、実験を開始する前に長期の暴露を避ける。報告されたいくつかの酸素掃気システムのいずれかのバッファからの酸素の枯渇が有用であろう。
一時的な中間状態に関する情報を取得する機能は、核融合反応を正確に同期されている必要があります。使用される流量と入口配管とフローセルのチャンネルのデッドボリュームは同期を制限することができる要因である。融合は、酸性pHの緩衝のための中立的な交換によって開始されます。酸性緩衝がフローセルにインレットチューブを通過するようにしかし、2つのバッファ間のインターフェイスは、拡散によって混合し、次第によく定義されることになります。二重層の表面で生じるpHの勾配は、開始時刻の決定をあいまいにする傾向があります。さらに、融合動態はプロトン濃度に依存するため、実験開始時のpH勾配は、結果の解釈を複雑にすることができます。ここに示した実験では、核融合の反応速度はpHの遷移時間よりもはるかに遅いです、そして勾配の効果が大幅に融合動力学に影響を与えません。我々は現在、私たちはフローセルに流れを迂回する前に、目的のバッファを使用してインレットチューブを準備できるようになる私達の流れの細胞への変更に取り組んでいます。
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Acknowledgments
作品は、NIHの助成金AI57159（SCH）およびAI72346（AMvOまで）によってサポートされていました。 SCHは、ハワードヒューズ医学研究所の研究者です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning cover glass squares, 25 mm | Sigma-Aldrich | CLS286525 | |
| Fused silica slides | Technical Glass | ||
| Staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| (3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane | Gelest Inc. | SIG5840.1 | |
| Dextran T-500 | Pharmacosmos | 5510 0500 4006 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850375 | |
| 1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850457 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipid, Inc | 700000 | |
| N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE) | Invitrogen | B1616 | |
| Streptavidin, fluorescein conjugate | Invitrogen | S-869 | |
| Disialoganglioside GD1a from bovine brain | Sigma-Aldrich | G2392 | |
| Mini Extruder | Avanti Polar Lipid, Inc | 610000 | |
| 0.1 micron polycarbonate membrane filters | Whatman, GE Healthcare | 800309 | |
| 10 mm drain discs (membrane supports) | Whatman, GE Healthcare | 230300 | |
| Sulforhodamine b sodium salt | S1402 | ||
| Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18) | See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol | ||
| PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Nikon fluorescence microscope | Nikon Instruments | TE2000-U | |
| Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective | Nikon Instruments | ||
| Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser | Coherent Inc. | ||
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702213 |
References
- Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers. Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).
- Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).
