Summary
우리는을 제시
Abstract
막 융합이 세포로 싸여 바이러스의 항목 중에 필수적인 단계입니다. 기존의 퓨전 assays은 일반적으로 어려운 것인 관련된 분자 단계의 순서를 분석하고, 퓨전 이벤트의 다수에 대한 리포트입니다. 우리는 체외에서 본질적으로 유동적인 지원 대상 이중층 단일 바이러스 입자의 융합의 속도론을 모니터하는 두 색 형광 분석을을 개발했습니다.
인플루엔자 바이러스 입자는 멤브레인 및 바이러스 인테리어를 얼룩이 빨간색 친수성 형광단를 얼룩이 녹색 lipophilic 형광단와 incubated 있습니다. 우리는 흐름 세포의 dextran - functionilized 유리 표면에 ganglioside 함유 지질 이중층을 입금, CCD의 입자의 수백을 포함, 평면 이중층 및 이미지 100 X 100 μm의 두 영역의 형광에 바이러스 입자를 품어 카메라. 이미징 모두 빨간색과 녹색 형광함으로써, 우리는 동시에 막 색소 (녹색) 및 입자의 수성 내용 (빨간색)의 동작을 모니터링할 수 있습니다.
퓨전 산도 아래 값을 산도를 낮출되면 입자는 세포막과 융합됩니다. Hemifusion은 대상 막의 바깥쪽 전단지와 입소문 막의 바깥 전단지의 병합, 입자의 녹색 형광의 갑작스런 변화로 볼 수 있습니다. 남은 두 말초 전단지의 후속 융합되면 기공이 형성되고 바이러스 입자의 빨간 발광 형광단은 대상 막에 따라 공개됩니다. 이 행사는 개별 입자의 붉은 형광의 감소로 상승을 제공합니다. 마지막으로, 대상 막에 포함된 산도에 민감한 형광단에서 통합 형광이 산도 드롭의 정확한 시간에보고합니다.
세 형광 시간의 흔적에서 모든 중요한 이벤트 (산도 드롭, 기공 형성에 혼합 hemifusion, 컨텐츠에 따라 혼합 지질)는 이제 간단한 방법으로 개별적으로 모든 입자에 대한 추출하실 수 있습니다. histograms에 많은 개별적인 입자에 대한 다양한 변환에 대한 경과 시간을 수집하여, 우리는 해당 중간체의 수명을 결정할 수 있습니다. 직접 형광 관찰가 없어도 숨겨진 중간체는 이러한 histograms에서 직접 시각하실 수 있습니다.
Protocol
유리 커버 슬립 작용화
퓨전 분석에 사용되는 평면 이중층은 dextran의 수산화 필름에서 지원됩니다. Dextran은 평면 이중층과 유리 표면 사이에 스페이서 역할을합니다. 이것은 유리 표면에 붙어되는 것을 막 구성 요소를 방지할 수 있으며 바이러스 입자의 내용이 융합시 탈출 수있는에 공간을 제공합니다. 유리 coverslips 우리가 화학적으로 결합 dextran에 유리 (Elender, 외. 1996) 수 실란 에폭시와 치료를 통해 작용하고 있습니다.
- 세라믹 얼룩의 랙에 25mm coverslips을 마련하고, JAR 또는 비커에 선반을 배치.
- 실험실 등급 유리 세제의 10 % 용액으로 컨테이너를 채웁니다. 30 분 초음파 청소기의 컨테이너를 놓습니다.
- 1M postassium 수산화와 용기와 coverslip 걸이 탈이온수과 함께, 그리고 리필 린스. 다른 30 분 동안 목욕 sonicator에 컨테이너를 반환합니다.
- 아세톤과 에탄올을 사용하여 청소 절차를 반복합니다.
- 물, 건조에 coverlips을 씻어.
- 마지막으로, 3 분 산소 플라즈마 스트리퍼 coverslips를 청소하십시오.
- 마지막 청소 단계는 다음 silanization 단계에있는 유리가 균일하게 친수성 및 반응하고, 표면을 산화.
- 이소프로판올 3 - glycidoxypropyltrimethoxy 실란의 0.2 % 용액을 준비합니다. 5 분 동안이 솔루션에 coverslips 젖어.
- 실란 솔루션을 취소하고 이소프로판올에 coverslips 여러 번 씻어.
- coverslips 지금 실란의 레이어 코팅 있지만, 그들은 유리에 covalently 결합하는 실란 수 있도록 치료해야합니다. 한 시간 만이라도 섭씨 27 도의 온도로 설정된 오븐에 coverslips를 놓습니다.
- coverslips가 치료하는 동안, dextran 500 밖으로 무게와 30 % W / V 솔루션을 준비합니다. 물을 예열하면 해체를 지원합니다. 우리는 coverslip마다이 솔루션의 약 1 ML을 사용합니다. dextran이 해소되면, 진공 건조기에서 솔루션을 defoam.
- silanized coverslips은 치료가 완료되면, 세라믹 랙에서 그들을 제거하고 플라스틱 냉동실 상자의 안쪽에 그들이 평평하게 주선해드립니다. dextran 솔루션 ~ 1 ML 각 coverslip의 상단 표면을 커버하기 위해 1 ML의 피펫을 사용합니다. 냉장고 상자를 닫고 24~36시간을위한 조용한 장소에 둡니다.
- 플라스틱 집게로 coverslips 쥐고 있지만, 초과 dextran을 부어 및 세라믹 랙에 그들을 대체합니다. 물속에 coverslips 여러 번 씻어하고 coverslips는 48 시간 동안 물에 담그다 수 있습니다. 항아리는 부드럽게 테이블 톱 회전에 흥분 수 있습니다.
- 80 섭씨와 진공 건조기에 저장하도록 설정 오븐에 coverslips 건조.
리포좀 준비
지원 지질 bilayers는 dextran 기능화 coverslip에 liposomes를 adsorbing에 의해 형성됩니다. 막 파열 및 표면에 평평하게 퍼져 때까지 둘은 서로 함께 adsorbed liposomes 퓨즈.
- 분석에 사용되는 일반적인 리포좀 제형은 1,2로 구성되어 dioleoyl - SN - glycero - 3 - phosphocholine (DOPC), 1 - oleoyl - 2 - palmitoyl - SN - glycero - 3 - phosphocholine (POPC), 콜레스테롤, 보빈 뇌 Disialoganglioside (GD 1A) 및 N - ((6 - (biotinoyl) 아미노) hexanoyl) 4:4:2:0.1:5의 비율 X10 -5에서 -1,2 - dihexadecanoyl - SN - glycero - 3 - phosphoethanolamine. 모든 구성 요소는 클로로포름 또는 클로로포름과 메탄올이 솔루션에 저장됩니다.
- 유리 시험관에 각 구성 요소의 볼륨을 전송하여 지질의 두 micromoles을 포함하는 혼합물을 준비합니다. 아르곤 또는 질소 가스 스트림에서 용매를 증발. 두 시간 동안 진공 건조기에서 테스트 튜브를 떠나하여 남아있는 용매를 제거합니다.
- HNE 버퍼 400 microliters (5 MM의 HEPES, 145 MM NaCl, 0.1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))에 말린 지질 필름을 Resuspend.
- 플라스틱 microcentrifuge 관에 정지를 전송합니다. 온수 욕조에 액체 질소 욕조와 해동의 현탁액을 고정. 이 동결 / 해동 사이클에게 네 번 반복합니다.
- 100 nm의 폴리 카보 네이트 막 필터와 지질 압출기를 조립하고, 지질 정지 25 번 돌출. 서스펜션은 압출 후 더 투명으로 나타납니다.
- Liposomes은 그들이 준비하는 일에 사용해야합니다. 사용하기 전까지 그들은 상온에서 저장할 수 있습니다.
Microfluidic 흐름 셀 준비
간단한 microfluidic 흐름 세포는 석영 슬라이드와 기능화 coverslip 사이의 이중 스틱 테이프를 sandwiching에 의해 이루어집니다.
- 20x20x3 mm 석영 슬라이드를 구합니다. 반대편에 두 1mm 구멍을 드릴 수있는 다이아몬드 버를 사용합니다.
- 이중 스틱 테이프의 시트에서 20mm 광장 컷하고, 면도날을 사용하여 중앙에서 15 X 2mm 부분을 도려.
- 하나 테이프 백업의 측면, 그리고 쿼트 테이프를 준수에서 필Z 슬라이드. 기능화 coverslip에 반대편을 준수합니다.
- 폴리에틸렌 튜빙의 두 20cm 길이를 잘라 석영 슬라이드에있는 구멍에 그들을 삽입합니다.
- 5 분 에폭시 접착제로 흐름 전지를 밀봉합니다.
- 버퍼와 접착제가 치료가, 총리 흐름 전지 및 튜브.
- 지원되는 지질 이중층은 채널로 리포좀 현탁액의 약 80 microliters를 그림으로써이 단계에서 형성된 수 있습니다.
바이러스 입자 라벨
- H3N2 인플루엔자는 (X - 31) 일반적으로 융합 분석에 사용하지만, 다른 독감 종자와 다른 바이러스가 성공적으로 사용되었습니다.
- 바이러스는 hemifusion과 기공 - 형성의 검출을 허용하는 두 개의 서로 다른 형광 염료로와 표시됩니다.
- 20 MM 솔루션을 만들기 위해 HNE 버퍼에 sulforhodamine B (SRB)을 디졸브. 바이러스 정지 10 microliters와 염료 용액 20 microliters을 결합, 20 시간 동안 실온에서 둡니다. 이 기간 동안 염료 천천히 바이러스 입자 내부에 축적됩니다.
- PD - 10 탈염 칼럼을 통해 바이러스 현탁액을 통과하여 여분의 염료를 제거합니다. 충분한 바이러스 재료를 사용하는 경우, 컬러 밴드가 열에 볼 수 있습니다. 이 밴드는 레이블이 바이러스를 포함하고 그것이 eluted 그대로 수령하실 수 있습니다.
- 어떤 밴드는 볼 수 없다면, 200 microliter의 분수를 수집하고 분광 광도계에서 565 nm의 흡수를 측정하여 바이러스로 분류가 포함되어있는 분수를 결정합니다. 바이러스는 약 0.8 ML의 총 볼륨 elute한다.
- SRB 표시 바이러스 중지 octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18)의 2 디메틸 포름 아미드 MM (DMF) 용액 13 microliters을 추가하여 바이러스 봉투 라벨.
- 실험실 회전에 튜브를 장착하여 정지를 저어하고 3 시간 동안 둡니다.
- 전에 설명한 것처럼 PD - 10 탈염 칼럼을 사용하여 초과 Rh110C18에서 바이러스를 정화.
현미경 구성
실험은 총 내부 반사 형광 현미경에 적합한 높은 NA 오일 침지 목적이 장착된 형광 현미경에서 수행됩니다. 아르곤 / 크립톤 가스 레이저에서 488 및 568 nm의 라인은 Rh110C18 및 SRB 라벨 바이러스를 자극하는 데 사용됩니다. 각 레이블의 동시 이미징은 분할 이색성 거울과 함께 녹색과 빨간색 형광 방출에 의해 성취와 독립적으로 전자 곱한 CCD 카메라 별도의 반쪽에 이미지를 집중하고있다.
어세 공연
표시 바이러스 입자 코팅 플루오레신와 표면, 낮은 산도 버퍼 (그림 1A)과 반응의 개시의 도킹, 평면 지질 이중층의 조립 : 퓨전 분석의 실행 흐름 세포 내에서 생화학 구성 요소 stepwise 어셈블리를 포함 .
- 현미경 단계에 흐름 세포를 탑재하고, 분당 40 microliters의 속도로 흐름으로 설정 주사기 펌프에 아웃렛 튜빙을 연결합니다.
- HNE 300 microliters 흐르는 의해 초과 liposomes의 흐름 채널을 해제합니다.
- 현미경을 집중하고 488 nm의 라이트와 568 nm의 빛이 70 W / cm 2 350 W / cm 2 표면을 조명하는 레이저 파워를 조정합니다. 당신은 1.45 NA 60x 기름 침지 목표를 사용하는 경우에는 각각 100 마이크로 왓츠, 20 마이크로 왓츠 레이저 농도를 설정합니다.
- 흐름 세포에 표시된 바이러스 (1 / 100 희석) 펌프. 바이러스가 유동 채널의 바닥 표면 diffuses으로 입자는 지질 이중층에 통합 ganglioside에 집중하기 시작합니다.
- 도킹 바이러스 입자의 적절한 밀도 (최대 전망 분야 1000 주위 입자)를 달성되었을 때. 밀리리터 플루오레신 표시 streptavidin마다이 마이크로 그램을 포함하는 솔루션에 입구 튜빙을 전환합니다. 라벨 streptavidin은 이중층의 결합 지질 분자를 비오틴에 바인딩되며, 결국 희미한 녹색 배경이 표시됩니다.
- HNE 300 microliters와 흐름 채널을 씻으십시오.
- , 이미지 영역을 선택 현미경을 집중하고 시간 타락한 이미지 수집을위한 CCD 카메라를 준비합니다. 100 MS에 노출 시간을 설정하고 10 Hz의 속도로 프레임을 수집합니다.
- 10 MM 나트륨 구연 산염 및 140 MM NaCl을 포함하는 산성 버퍼에 흐르는으로 퓨전을 시작합니다. 버퍼의 산도는 assayed되는 바이러스의 중요한 산도 아래로 조정해야합니다. 산도에서 X - 31 퓨즈는 아래 5.5의.
대표 결과
그림 1B는 융합 전과 중에 이중층 도킹 virions의 스냅샷을 보여줍니다. 각각의 회절 제한된 장소는 개별 바이러스 입자를 나타냅니다. 적색과 녹색의 형광은 별도로 바이러스 봉투와 컨텐츠 레이블의 동시 관찰을 허용, CCD 카메라의 상단과 하단 반쪽에 몇 군데있다. 에 비해 녹색 채널에 두 배나 많은 명소가 일반적으로있다빨강, 이것은 봉투 레이블에 비해 콘텐츠 염료로 라벨의 낮은 효율성을 반영합니다. 플루오레신를 바운드 표면에서 방출 녹색 배경 형광은 구연 산염 버퍼의 도착 사라지고 융합 반응의 시작 시간을 결정 수 있습니다. Hemifusion 이벤트 hemifusion의 줄기를 통해 바이러스 봉투 diffuses의 침묵 Rh110C18로 녹색 형광의 파열로 감지되며 평면 막에 희석합니다. 외부 확장 형광 구름은 평면 막의 지방산 - 아실 연결된 염료의 무료 보급을 보여주는, hemifused 입자 주위에 볼 수 있습니다. 기공 형성은 바이러스 입자의 내부 안에 갇힌 SRB에서 빨간색 형광의 부패로 관찰됩니다. 퓨전 기공의 개통은 염색이 관찰 지역의 평면 이중층 밖으로 아래 수성 공간으로 탈출 할 수 있습니다.
각 입자에 대한 형광 강도의 탄도는 개별 입자의 통합 농도에서 꾸몄다 hemifusion 및 기공 형성 (그림 1C)의 수율 및 시간 결정을 용이하게합니다. Hemifusion 및 기공 형성 이벤트 시간은 Rh110C18 형광 버스트 또는 SRB 신호 부패의 최대 기울기가 발생하는 시점으로 결정됩니다. 성공적인 실험에서 Rh110C18 항복 dequenching 신호 및 SRB 라벨 입자의 30 %로 표시된 입자의 약 50 %는 유용한 신호를 제공합니다. 두 염료로 표시된 입자의 약 10 %가 모두 지질 혼합 및 기공 형성 신호를 보여줍니다.
그림. 2A - C는 전형적인 실험에서 hemifusion 및 기공 형성 지연 시간의 분포를 보여줍니다. Fig.2D - F는 같은 조건에서 수행 다섯 실험에서 결합된 이벤트 이벤트 배포판을 보여줍니다. 도 관찰 겸손한 번호, histograms의 형태는 분명합니다. 각 실험은 산도 드롭 시간의 감지에 의해 동기화되기 때문에, 여러 실험은 결합 수 있으며, 중간 단계를 제한 속도에 대한 자세한 정보를 얻을 수 있습니다.
그림 1. 실험 설계. A) 바이러스 입자는 hemifusion와 융합 기공 형성 속도론을 모니터하는 두 형광 염료와 함께 표시됩니다. 형광은 높은 NA 현미경의 목적이 수집하여 CCD에 몇 군데 있습니다. B) 형광 이미지를 전 (왼쪽)와 중 (오른쪽) 개별 바이러스 입자의 융합. 각 이미지의 위쪽과 아래쪽 절반 지원 이중층의 동일한 ~ 50 X 100mm이 지역의 각각 빨간색과 녹색 형광과 일치합니다. C) 붉은 SRB 바이러스성 내용 추적 (상단 트레이스)의 형광 강도는 녹색 Rh110C18 멤브레인 염료 (중앙 추적) 및 플루오레신 산도 센서 (낮은 추적) 산도 드롭, hemifusion, 그리고 퓨전 사이에 경과한 정확한 시간을 제공합니다. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
그림 2. 찬란 분류 바이러스의 퓨전 속도론. 산도 드롭 및 hemifusion (A, D)과 기공 형성 (B, E) 사이의 경과 시간의 배포판. 배포판의 상승과 부패는 여러 중간 단계의 존재를 나타냅니다. hemifusion 및 개별 입자의 융합 기공의 개방 사이의 전환은 기하 급수적으로 단일 속도 - 제한 단계를 제안, 배포됩니다. 패널 AC는 단일 실험의 결과를 보여줍니다. 패널 DF는 동일한 조건에서 수행 다섯 별도의 실험에서 컴파일됩니다. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 2의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
유체 및 지속적인 지원 지질 bilayers의 준비 도전하실 수 있습니다. 물질 또는 표면 결함을 오염 미량의은 bilayers의 확산 방지합니다. dextran의 유니폼 레이어주의 청소와 증언이 필수적입니다.
바이러스 입자의 장시간 영상 표백제 형광 라벨을하거나 그들이 inactivated 될 발생할 수 있습니다. 이런 종류의 사진 손상이 잘 바이오 이미징 및 단일 분자 분야에 알려져 있고, 일반적으로 흥분 fluorophores의 반응 산소 종의 생성에서 줄기로 생각됩니다. 사진 피해를 최소화하기 위해, 우리는 일반적으로 여기 레이저의 파워를 최소화하고 사전에 실험을 시작하기 위해 장시간 노출하지 마십시오. 보고된 여러 산소 청소 시스템 중 하나를 사용하여 버퍼에서 산소 고갈이 유용 수 있습니다.
과도 중간 상태에 대한 정보를 얻을 수있는 능력이 융합 반응을 정확하게 동기화되어야합니다. 사용 유량과 입구 관 그리고 흐름 세포 채널 죽음의 볼륨 동기화를 제한할 수 요소입니다. 퓨전은 산성 pH의 버퍼에 대해 중립적인 교환에 의해 시작됩니다. 산성 버퍼 흐름 세포로 유입 튜브를 통해 여행 그러나, 두 버퍼 사이의 인터페이스는 확산을 통해 믹스하고 점차적으로 덜 잘 정의된다. 이중층의 표면에서 발생하는 산도 기울기는 시작 시간을 결정 흐려하는 경향이있다. 융합 동력학은 프로톤 농도에 의존이기 때문에 또한, 실험의 시작 산도 기울기는 결과의 해석을 복잡하게 수 있습니다. 실험 여기서 시연에서, 융합의 반응 속도론은 산도 전이 시간보다 훨씬 느린이며, 그라디언트 효과는 크게 퓨전 속도론에 영향을주지 않습니다. 우리는 현재 우리가 흐름 셀에 흐름을 우회하기 전에 원하는 버퍼로 입구 튜빙을 프라임 시키는데 도움이 될 우리의 흐름 세포의 수정에 노력하고 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
작품은 NIH 교부금 AI57159 (SCH)을하고 AI72346 (AMvO)을 지원했다. SCH는 하워드 휴즈 의학 연구소의 탐정이다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning cover glass squares, 25 mm | Sigma-Aldrich | CLS286525 | |
| Fused silica slides | Technical Glass | ||
| Staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| (3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane | Gelest Inc. | SIG5840.1 | |
| Dextran T-500 | Pharmacosmos | 5510 0500 4006 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850375 | |
| 1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850457 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipid, Inc | 700000 | |
| N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE) | Invitrogen | B1616 | |
| Streptavidin, fluorescein conjugate | Invitrogen | S-869 | |
| Disialoganglioside GD1a from bovine brain | Sigma-Aldrich | G2392 | |
| Mini Extruder | Avanti Polar Lipid, Inc | 610000 | |
| 0.1 micron polycarbonate membrane filters | Whatman, GE Healthcare | 800309 | |
| 10 mm drain discs (membrane supports) | Whatman, GE Healthcare | 230300 | |
| Sulforhodamine b sodium salt | S1402 | ||
| Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18) | See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol | ||
| PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Nikon fluorescence microscope | Nikon Instruments | TE2000-U | |
| Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective | Nikon Instruments | ||
| Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser | Coherent Inc. | ||
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702213 |
References
- Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers. Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).
- Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).
