Méthode pour la mesure de la cinétique de fusion virale au niveau particule unique

Summary

Nous présentons une

Abstract

La fusion membranaire est une étape essentielle lors de l'entrée des virus enveloppés dans les cellules. Dosages de fusion conventionnel généralement un rapport sur un grand nombre d'événements de fusion, ce qui rend difficile pour l'analyse quantitative de la séquence des étapes moléculaires impliqués. Nous avons développé une étude in vitro, deux couleurs de fluorescence test pour contrôler la cinétique des particules du virus de la fusion simple avec une bicouche cible sur un support sensiblement fluide.

Particules virales de la grippe sont incubés avec un fluorophore lipophile pour tache verte de la membrane et un fluorophore rouge hydrophile pour colorer l'intérieur virale. Nous déposons une bicouche lipidique contenant du ganglioside sur la surface du verre dextrane-functionilized d'une cellule d'écoulement, incuber les particules virales sur la bicouche planaire et l'image de la fluorescence d'une 100 x 100 um ² zone, contenant plusieurs centaines de particules, sur un capteur CCD caméra. En imagerie à la fois la fluorescence rouge et verte, nous pouvons simultanément surveiller le comportement de la teinture de membrane (vert) et le contenu aqueux (rouge) des particules.

Après abaissement du pH à une valeur inférieure au pH de fusion, les particules vont fusionner avec la membrane. Hemifusion, la fusion de l'feuillet externe de la membrane virale avec le feuillet externe de la membrane cible, sera visible comme un changement soudain dans la fluorescence verte d'une particule. Lors de la fusion subséquente des deux autres tracts distal un pore sera formé et le fluorophore rouge émettant dans la particule virale sera publié sous la membrane cible. Cet événement donnera lieu à une diminution de la fluorescence rouge des particules individuelles. Enfin, la fluorescence d'un fluorophore intégrés sensibles au pH qui est incorporé dans la membrane cible des rapports sur l'heure exacte de la chute du pH.

De trois à fluorescence en temps des traces, tous les événements importants (chute du pH, de lipides de mixage sur hemifusion, mélanger le contenu à la formation de pores) peut maintenant être extraite d'une manière simple et pour chaque particule individuellement. En recueillant les temps écoulé pour les différentes transitions pour de nombreuses particules individuelles dans les histogrammes, nous pouvons déterminer la durée de vie des intermédiaires correspondantes. Même intermédiaires cachés qui n'ont pas une observable directement fluorescentes peuvent être visualisés directement à partir de ces histogrammes.

Protocol

Fonctionnalisation lamelle de verre

La bicouche planaire utilisé dans le dosage de fusion est pris en charge sur un film hydraté de dextrane. Dextran agit comme une entretoise entre la bicouche planaire et la surface du verre. Cela empêche les composants de la membrane de devenir collé sur la surface du verre et fournit également l'espace dans lequel le contenu d'une particule virale peut s'échapper lors de la fusion. Lamelles de verre sont fonctionnalisés par traitement avec une résine époxy silane, ce qui nous permet de dextrane chimiquement obligataire sur le verre (Elender, et al. 1996).

1. Disposez des lamelles de 25 mm dans un support de coloration céramique, et placez le support dans un bocal ou un gobelet.
2. Remplissez le récipient avec une solution à 10% de la verrerie de laboratoire de qualité détergent. Placer le récipient dans un nettoyeur à ultrasons pendant 30 minutes.
3. Rincer le contenant et le porte-lamelle à l'eau déminéralisée, et remplir avec de l'hydroxyde postassium 1M. Retourner le récipient au sonicateur de bain pour un autre 30 minutes.
4. Répétez cette procédure de nettoyage utilisant de l'acétone et l'éthanol.
5. Rincez le coverlips dans l'eau et à sec.
6. Enfin, nettoyez les lamelles avec un décapant plasma d'oxygène pour trois minutes.
7. L'étape de nettoyage dernière s'oxyde en surface, rendant le verre uniformément hydrophile et réactive dans les étapes suivantes silanisation.
8. Préparer une solution à 0,2% de 3-glycidoxypropyltriméthoxysilane silane dans l'isopropanol. Plonger les lamelles dans cette solution pendant cinq minutes.
9. Jeter la solution de silane et rincer la fois des lamelles de plusieurs dans l'isopropanol.
10. Les lamelles sont maintenant recouvertes d'une couche de silane, mais ils doivent être guéries pour permettre au silane pour coller de façon covalente sur le verre. Placez les lamelles dans un four réglé à 80 degrés Celsius pendant une heure.
11. Alors que les lamelles sont de séchage, peser 500 dextrane et préparer un 30% p / v de solution. Le préchauffage de l'eau va faciliter la dissolution. Nous allons utiliser environ 1 ml de cette solution par lamelle. Une fois que le dextrane a dissous, defoam la solution dans un dessiccateur à vide.
12. Lorsque les lamelles silanisées avez fini de séchage, les retirer de la grille de céramique et de les arranger à plat sur l'intérieur d'une boîte de congélation en plastique. Utiliser une pipette de 1 ml pour couvrir la surface supérieure de chaque lamelle avec ~ 1 ml de la solution de dextrane. Fermez la boîte de congélateur et laisser dans un endroit tranquille pour 24-36 heures.
13. Bien saisir les lamelles avec une pince en plastique, verser l'excédent de dextrane et de les remplacer dans le rack en céramique. Rincer la lamelles de plusieurs dans l'eau, et laissez les lamelles à tremper dans l'eau pendant 48 heures. Le pot peut être doucement agitée sur un agitateur de table.
14. Sécher les lamelles dans un four réglé à 80 degrés Celsius et conserver dans un dessiccateur à vide.

Préparation des liposomes

Bicouches lipidiques supportées sont formées par adsorption de liposomes à une lamelle de dextrane fonctionnalisé. Le fusible adsorbé liposomes avec eachother jusqu'au ruptures de membrane et se répand sur la surface plane.

1. Une formulation typique liposome utilisé dans le dosage se compose de 1,2, dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC), 1-oléoyl-2-palmitoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (POPC), le cholestérol, le cerveau bovin disialoganglioside (GD _1a), et N-((6 - (biotinoyl) amino) hexanoyle) -1,2-dihexadecanoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine dans un rapport de 4:4:2:0.1:5 x10 ^-5. Tous les composants sont stockés dans le chloroforme ou le chloroforme et des solutions de méthanol.
2. Préparer un mélange contenant deux micromoles de lipides par le transfert de volumes de chaque composant dans un tube à essai en verre. Évaporer le solvant sous un courant d'argon ou d'azote gazeux. Retirez le solvant restant en laissant le tube à essai dans un dessiccateur à vide pendant deux heures.
3. Remettre le film lipidique séché dans 400 microlitres de tampon HNE (5 mM HEPES, 145 mM NaCl, 0,1 mM EDTA).
4. Transférer la suspension dans un microtube plastique. Gel de la suspension dans un bain d'azote liquide et de dégel dans un bain d'eau tiède. Répétez ce cycle gel / dégel à quatre reprises.
5. Assembler une extrudeuse de lipides avec un filtre en polycarbonate de 100 nm à membrane, et d'extruder la suspension lipidique 25 fois. La suspension doit apparaître à être plus transparent après l'extrusion.
6. Les liposomes doit être utilisée le jour où ils sont préparés. Elles peuvent être stockées à température ambiante jusqu'à utilisation.

Microfluidiques préparation cellulaire de flux

Une cellule simple flux microfluidique est faite par adhésif double sandwich entre une diapositive de quartz et d'une lamelle fonctionnalisée.

1. Obtenir une diapositive 20x20x3 mm à quartz. Utilisez une fraise diamantée de forer deux trous de 1 mm sur les côtés opposés.
2. Couper un carré de 20 mm à partir d'une feuille de ruban adhésif double, et en utilisant une lame de rasoir, couper une section de 15 x 2 mm du centre.
3. Retirez un côté du support de bande, et faire adhérer le ruban à la pintez glisser. Respecter l'autre côté à une lamelle fonctionnalisée.
4. Coupez deux longueurs de 20 cm de tube en polyéthylène et les insérer dans les trous de la lame de quartz.
5. Sceau de la cellule d'écoulement avec de la colle époxy 5 minutes.
6. Quand la colle a durci, le premier de la cellule d'écoulement et les tubes avec du tampon.
7. Une bicouche lipidique soutenue peut être formé à ce stade par le dessin d'environ 80 microlitres de la suspension de liposomes dans les canaux.

L'étiquetage des particules de virus

1. H3N2 de la grippe A (X-31) est généralement utilisé pour le dosage de la fusion, mais d'autres souches de grippe et autres virus ont été utilisés avec succès.
2. Le virus est étiqueté avec un maximum de deux colorants fluorescents différents pour permettre la détection des hemifusion et des pores de formation.
3. Dissoudre sulforhodamine B (SRB) dans un tampon HNE pour faire une solution à 20 mM. Combinez 20 microlitres de la solution de colorant avec 10 microlitres de la suspension virale, et laisser à température ambiante pendant 20 heures. Durant cette période, le colorant va lentement s'accumuler à l'intérieur des particules virales.
4. Retirer l'excès de teinture en passant la suspension de virus de la grâce à une colonne PD-10 dessalage. Si suffisamment de matériel viral est utilisé, une bande de couleur peut être vu dans la colonne. Cette bande contient le virus étiquetés et peuvent être perçus comme il est élue.
5. Si aucune bande n'est visible, collecter des fractions de 200 microlitre et déterminer quelles fractions contiennent le virus étiquetés en mesurant l'absorption 565 nm sur un spectrophotomètre. Le virus doit éluer dans un volume total d'environ 0,8 ml.
6. Etiquette de l'enveloppe virale en ajoutant 13 microlitres d'un formamide 2 mM de diméthyle (DMF) solution de rhodamine octadécyle 110 (Rh110C18) à la suspension SRB virus marqués.
7. Incorporer la suspension en attachant le tube d'un rotateur de laboratoire et de laisser pendant 3 heures.
8. Purifier le virus de l'excès Rh110C18 utilisant une colonne PD-10 dessalage comme décrit précédemment.

Configuration de microscope

L'expérience est réalisée sur un microscope à fluorescence équipé d'un objectif de haute NA immersion adapté à la microscopie de réflexion totale de fluorescence interne. Les 488 et 568 nm de lignes d'un laser argon / krypton sont utilisés pour exciter le virus Rh110C18 et SRB étiquetés. L'imagerie simultanée de chaque étiquette est accomplie en divisant l'émission de fluorescence verte et rouge avec un miroir dichroïque et indépendante se concentrant sur les images moitiés séparées d'une caméra CCD d'électrons se multiplier.

La réalisation du test

Exécution de l'essai de fusion implique un assemblage progressif des composants biochimiques au sein de la cellule de flux: l'assemblage de la bicouche lipidique plane, l'amarrage de particules de virus étiquetés, de revêtement de la surface à la fluorescéine, et l'initiation de la réaction avec un tampon de faible pH (figure 1A) .

1. Montez le flux de cellules sur la platine du microscope, et attacher le tube de sortie d'une pompe seringue mis à couler à un taux de 40 microlitres par minute.
2. Effacer les canaux d'écoulement des liposomes en excès en circulant dans 300 microlitres de HNE.
3. Focus du microscope et d'ajuster la puissance du laser pour illuminer la surface avec 350 W / cm ² de 488 nm et la lumière 70 W / cm ² de 568 nm de lumière. Si vous utilisez un 1,45 NA 60x objectif à immersion d'huile, mettre les intensités laser à 100 Watts et 20 Watts micro micro, respectivement.
4. Pompe virus marqués (dilué 1 / 100) dans une cellule d'écoulement. Comme le virus se diffuse à la surface inférieure du canal d'écoulement, les particules vont commencer à coller à la ganglioside incorporé dans la bicouche lipidique.
5. Quand une densité adéquate de particules virales à quai a été atteint (jusqu'à environ 1000 particules par champ de vision). Mettre le tuyau d'admission à une solution contenant deux microgrammes par millilitre fluorescéine streptavidine marquée. La streptavidine marquée se lient à la biotine couplée molécules lipidiques dans la bicouche, et éventuellement un fond vert sombre sera visible.
6. Laver le canal d'écoulement avec 300 microlitres de HNE.
7. Choisissez une zone d'imagerie, la focalisation du microscope et de préparer la caméra CCD d'acquisition d'images de temps écoulé. Réglez le temps d'exposition de 100 ms et recueillir des images à une cadence de 10 Hz.
8. Initier la fusion en s'écoulant dans un tampon acide contenant 10 mM citrate de sodium et 140 mM de NaCl. Le pH du tampon doit être ajustée pour être en dessous du pH critique du virus étant dosé. X-31 fusibles à des pH inférieur à 5,5.

Les résultats représentatifs

Figure 1B montre des instantanés de bicouche virions amarré avant et pendant la fusion. Chaque tache de diffraction limitée représente une particule virale individuels. Rouge et vert de fluorescence ont été séparément imagée sur les moitiés supérieure et inférieure d'une caméra CCD, permettant l'observation simultanée de l'enveloppe virale et les étiquettes de contenu. Il ya généralement deux fois plus nombreuses taches dans le canal vert par rapport àle rouge, et cela reflète le faible efficacité de l'étiquetage par le colorant contenu par rapport à l'étiquette de l'enveloppe. La fluorescence de fond verte émise par la surface liée fluorescéine disparaît à l'arrivée du tampon citrate et permet la détermination de l'heure de début de la réaction de fusion. Des événements sont détectés comme Hemifusion éclats de fluorescence verte que l'Rh110C18 trempé dans l'enveloppe virale se diffuse à travers la tige hemifusion et se dilue dans la membrane planaire. Un nuage en expansion vers l'extérieur fluorescente peut être vu autour des particules hemifused, démontrant la libre diffusion du colorant gras acyle liés à la membrane plane. Formation de pores est observé que la désintégration de la fluorescence rouge du SRB piégés à l'intérieur des particules virales. L'ouverture d'un pore de fusion permet à la teinture de s'échapper dans l'espace ci-dessous la bicouche aqueuse planaire et hors de la région d'observation.

Trajectoires d'intensité de fluorescence de chaque particule, tracée à partir des intensités intégrées des particules individuelles, de faciliter la détermination du rendement et de temps de formation de pores et de hemifusion (Fig. 1C). Les heures des événements Hemifusion et la formation des pores sont déterminés comme le point où la pente maximale d'une rafale Rh110C18 signal de fluorescence ou la carie survient SRB. Dans une expérience réussie, environ 50 pour cent des particules marquées avec des signaux Rh110C18 dequenching rendement, et 30 pour cent des particules de SRB étiquetées donnent le signal utilisable. Parmi les particules marquées à la fois avec les colorants, environ 10 pour cent montrent deux signaux de mélange et la formation des lipides pores.

Fig. 2A-C montre la distribution des pores et des temps hemifusion formation de lag d'une expérience typique. Fig.2D-F montre distributions cas d'épreuves combinées à partir de cinq expériences réalisées dans les mêmes conditions. Même avec un nombre modeste d'observations, la forme des histogrammes est apparente. Parce que chaque expérience est synchronisé par la détection du temps de chute du pH, des expériences multiples peuvent être combinés et des informations détaillées sur la limitation du débit des étapes intermédiaires peuvent être obtenues.

Figure 1. Conception expérimentale. A) Les particules virales sont étiquetés avec deux colorants fluorescents pour suivre la cinétique de formation de pores et de hemifusion fusion. La fluorescence est recueillie par un objectif de microscope haute-NA et imagée sur une caméra CCD. B) les images de fluorescence avant (à gauche) et pendant (à droite) la fusion des particules virales individuelles. Moitié supérieure et inférieure de chaque image correspond à la fluorescence rouge et vert, respectivement, de la même zone ~ 50 x 100 mm ² de la bicouche en charge. C) L'intensité de fluorescence du traceur rouge SRB contenu viral (tracé supérieur), le vert Rh110C18 la membrane (au milieu de traces) de teinture, et le capteur de pH fluorescéine (trace inférieure) de fournir les heures exactes sont écoulés entre la diminution du pH, hemifusion, et la fusion. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version agrandie de la figure 1.

Figure 2. Cinétique de fusion du virus marqué par fluorescence. Les distributions du temps écoulé entre la chute du pH et hemifusion (A, D) et la formation de pores (B, E). La montée et la décomposition des distributions indiquent la présence de plusieurs étapes intermédiaires. La transition entre hemifusion et l'ouverture d'un pore de fusion des particules individuelles est exponentiellement distribués, ce qui suggère une seule étape limitante. Panneaux AC montrent les résultats d'une expérience unique. DF panneaux sont compilés à partir de cinq expériences distinctes effectuées dans les mêmes conditions. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version agrandie de la figure 2.

Discussion

Préparation du fluide et continu bicouches lipidiques supportées peut être difficile. Des traces de contamination de défauts matériels ou de surface permettra d'éviter la propagation de bicouches. Nettoyage soigneux et dépôt d'une couche uniforme de dextrane sont essentiels.

Imagerie prolongée des particules de virus peuvent blanchir les marqueurs fluorescents ou les amener à devenir inactivé. Photo-dommages de ce type est bien connu dans la bio-imagerie et des champs molécule unique et est généralement considéré comme la tige de la génération d'espèces réactives de l'oxygène par les fluorophores excités. Afin de minimiser la photo-dommages, nous avons généralement de minimiser la puissance du laser d'excitation et d'éviter une exposition prolongée avant de commencer l'expérience. L'épuisement de l'oxygène à partir des tampons avec l'un des systèmes d'oxygène de plusieurs balayage rapporté peut s'avérer utile.

La capacité à obtenir des informations sur les états intermédiaires transitoires exige que la réaction de fusion est précisément synchronisés. Le débit utilisé et le volume mort de la tubulure d'entrée et le canal d'écoulement de cellule sont des facteurs qui peuvent limiter la synchronisation. La fusion est initiée par l'échange neutre pour tampon de pH acide. Toutefois, comme le tampon acide traverse la tubulure d'entrée dans la cellule de débit, l'interface entre les deux tampons mêle à travers la diffusion et devient progressivement moins bien définis. Le gradient de pH résultant à la surface bicouche tend à brouiller la détermination de l'heure de début. En outre, depuis la fusion cinétique est dépendante de la concentration de protons, un gradient de pH au début de l'expérience pourrait compliquer l'interprétation des résultats. Dans l'expérience a démontré ici, la cinétique de fusion est beaucoup plus lent que le temps de transition de pH, et l'effet de gradient n'affecte pas significativement la cinétique de fusion. Nous travaillons actuellement sur des modifications à notre flux de cellules qui nous permettrait d'amorcer la tubulure d'entrée avec le tampon souhaité avant détourner le flux dans la cellule de flux.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corning cover glass squares, 25 mm	Sigma-Aldrich	CLS286525
Fused silica slides	Technical Glass
Staining rack	Thomas Scientific	8542E40
(3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane	Gelest Inc.	SIG5840.1
Dextran T-500	Pharmacosmos	5510 0500 4006
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Avanti Polar Lipid, Inc	850375
1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti Polar Lipid, Inc	850457
Cholesterol	Avanti Polar Lipid, Inc	700000
N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE)	Invitrogen	B1616
Streptavidin, fluorescein conjugate	Invitrogen	S-869
Disialoganglioside GD1a from bovine brain	Sigma-Aldrich	G2392
Mini Extruder	Avanti Polar Lipid, Inc	610000
0.1 micron polycarbonate membrane filters	Whatman, GE Healthcare	800309
10 mm drain discs (membrane supports)	Whatman, GE Healthcare	230300
Sulforhodamine b sodium salt		S1402
Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18)			See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol
PD-10 desalting columns	GE Healthcare	17-0851-01
Nikon fluorescence microscope	Nikon Instruments	TE2000-U
Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective	Nikon Instruments
Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser	Coherent Inc.
Syringe Pump	Harvard Apparatus	702213