Summary
हम एक वर्तमान
Abstract
झिल्ली संलयन छा वायरस की कोशिकाओं में प्रवेश के दौरान एक आवश्यक कदम है. परम्परागत संलयन assays आमतौर पर संलयन घटनाओं की एक बड़ी संख्या पर रिपोर्ट, यह मुश्किल मात्रात्मक आणविक शामिल कदम के अनुक्रम का विश्लेषण कर रही है. हम इन विट्रो में एक विकसित किया है, दो रंग प्रतिदीप्ति परख के लिए अनिवार्य रूप से एक तरल पदार्थ के समर्थन पर एक लक्ष्य bilayer के साथ एक वायरस कणों fusing के कैनेटीक्स की निगरानी.
इन्फ्लुएंजा वायरल कणों एक हरे रंग की lipophilic झिल्ली और एक लाल हाइड्रोफिलिक fluorophore वायरल इंटीरियर दाग दाग fluorophore के साथ incubated हैं. हम dextran functionilized एक प्रवाह कक्ष के कांच की सतह पर एक लिपिड ganglioside युक्त bilayer जमा, planar bilayer और एक 100 x 100 सुक्ष्ममापी 2 क्षेत्र के प्रतिदीप्ति छवि पर वायरल कणों को सेते हैं, जिसमें कणों की एक सीसीडी पर कई सैकड़ों , कैमरा. इमेजिंग दोनों लाल और हरे रंग प्रतिदीप्ति करके, हम एक साथ झिल्ली (हरा) डाई और कणों के जलीय सामग्री (लाल) के व्यवहार की निगरानी कर सकते हैं.
संलयन पीएच नीचे एक मूल्य के लिए पीएच कम होने पर, कणों झिल्ली के साथ फ्यूज होगा. Hemifusion, लक्ष्य झिल्ली की बाहरी पत्रक के साथ वायरल झिल्ली के बाहरी पत्रक के विलय, एक कण की हरी प्रतिदीप्ति में अचानक परिवर्तन के रूप में दिखाई देगा. दो शेष बाहर का पत्रक के बाद संलयन करने पर एक ताकना और गठन किया जाएगा वायरल कण में fluorophore लाल उत्सर्जन लक्ष्य झिल्ली के तहत जारी किया जाएगा. इस घटना को व्यक्तिगत कणों के लाल प्रतिदीप्ति की कमी को जन्म दे देंगे. अंत में, एक fluorophore पीएच प्रति संवेदनशील है कि लक्ष्य झिल्ली में एम्बेडेड है से एकीकृत प्रतिदीप्ति पीएच बूंद का सही समय पर रिपोर्ट.
तीन प्रतिदीप्ति समय निशान से सभी महत्वपूर्ण घटनाओं (पीएच ड्रॉप, hemifusion, ताकना गठन पर मिश्रण सामग्री पर मिश्रण लिपिड) अब एक सरल तरीके से और हर कण के लिए व्यक्तिगत निकाला जा सकता है. हिस्टोग्राम में कई व्यक्तिगत कणों के लिए विभिन्न संक्रमण के लिए elapsed समय एकत्रित करके, हम इसी मध्यवर्ती जन्मों के निर्धारित कर सकते हैं. यहां तक कि छिपा मध्यवर्ती है कि एक प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट नमूदार नहीं है इन histograms से सीधे कल्पना कर सकते हैं.
Protocol
ग्लास कवर पर्ची functionalization
तलीय संलयन परख में इस्तेमाल किया bilayer dextran का एक हाइड्रेटेड फिल्म पर समर्थित है. Dextran planar bilayer और कांच की सतह के बीच एक स्पेसर के रूप में कार्य करता है. यह गिलास सतह पर अटक बनने से झिल्ली घटकों को रोकता है और यह भी जो एक वायरस कण की सामग्री संलयन पर बच सकता अंतरिक्ष प्रदान करता है. ग्लास coverslips एक silane epoxy, जो हमें रासायनिक बांड dextran ग्लास (Elender, एट अल 1996.) की अनुमति देता है है के साथ उपचार के माध्यम से functionalized हैं.
- एक चीनी मिट्टी धुंधला रैक में 25 मिमी coverslips व्यवस्थित, और एक जार या बीकर में रैक जगह है.
- प्रयोगशाला ग्रेड कांच के बने पदार्थ डिटर्जेंट के एक 10% समाधान के साथ कंटेनर भरें. 30 मिनट के लिए एक अल्ट्रासोनिक क्लीनर में कंटेनर रखें.
- 1M postassium हीड्राकसीड के साथ कंटेनर और विआयनीकृत जल के साथ coverslip रैक, और फिर से भरना कुल्ला. एक और 30 मिनट के लिए स्नान sonicator के लिए कंटेनर लौटें.
- इस सफाई एसीटोन और इथेनॉल का उपयोग कर प्रक्रिया को दोहराएँ.
- पानी और सूखी में coverlips कुल्ला.
- अंत में, तीन मिनट के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा खाल उधेड़नेवाला के साथ coverslips साफ.
- पिछले सफाई कदम सतह oxidizes, गिलास समान हाइड्रोफिलिक और निम्न silanization चरणों में प्रतिक्रियाशील.
- Isopropanol में एक 3-glycidoxypropyltrimethoxy silane के 0.2% समाधान तैयार करें. पांच मिनट के लिए इस समाधान में coverslips विसर्जित कर दिया.
- Silane समाधान त्यागें और isopropanol में coverslips कई बार कुल्ला.
- coverslips अब silane की एक परत के साथ लेपित हैं, लेकिन वे कांच को covalently बंधन को silane की अनुमति के लिए ठीक होना चाहिए. एक एक घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट ओवन में coverslips रखें.
- जबकि coverslips इलाज कर रहे हैं, dextran 500 वजन और एक 30% समाधान w / ध् तैयार. पानी preheating विघटन सहायता करेगा. हम coverslip प्रति इस समाधान के लगभग 1 मिलीलीटर का उपयोग करेगा. एक बार dextran भंग कर दिया है, एक निर्वात desiccator में समाधान defoam.
- जब silanized coverslips इलाज समाप्त कर दिया है, चीनी मिट्टी के रैक से उन्हें हटाने और उन्हें एक प्लास्टिक फ्रीजर बॉक्स के अंदर पर फ्लैट की व्यवस्था. 1 मिलीलीटर विंदुक प्रयोग ~ dextran समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक coverslip के ऊपर की सतह को कवर. फ्रीजर बॉक्स बंद करें और 24-36 घंटे के लिए एक शांत जगह में छोड़ दें.
- जबकि प्लास्टिक संदंश के साथ लोभी coverslips से अतिरिक्त dextran डालना और उन्हें चीनी मिट्टी रैक में बदलें. पानी में coverslips कई बार कुल्ला, और coverslips पानी में 48 घंटे के लिए सोख करने की अनुमति. जार धीरे एक टेबल शीर्ष अंग को घुमानेवाली पेशी पर उत्तेजित हो सकता है.
- एक ओवन में 80 डिग्री सेल्सियस और एक निर्वात desiccator में दुकान करने के लिए सेट coverslips सूखी.
Liposome तैयारी
लिपिड bilayers समर्थित एक dextran functionalized coverslip liposomes adsorbing द्वारा गठित कर रहे हैं. adsorbed eachother के साथ झिल्ली ruptures और फ्लैट सतह पर फैलता है जब तक liposomes फ्यूज.
- एक ठेठ liposome परख में प्रयुक्त तैयार 1,2 के होते हैं, (DOPC) dioleoyl एस.एन. - glycero - 3 - phosphocholine, (POPC 1) - oleoyl-2-palmitoyl - एस.एन. - glycero-3-phosphocholine, कोलेस्ट्रॉल, गोजातीय मस्तिष्क Disialoganglioside (जी.डी. 1a) और एन ((6 - (biotinoyl) एमिनो) hexanoyl) 4:4:2:0.1:5 -5 x10 के अनुपात में -1,2 dihexadecanoyl - एस.एन. - glycero-3-phosphoethanolamine. सभी घटकों क्लोरोफॉर्म या क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल समाधान में संग्रहीत हैं.
- एक लिपिड का एक गिलास टेस्ट ट्यूब में प्रत्येक घटक की मात्रा को स्थानांतरित कर दो micromoles युक्त मिश्रण तैयार है. Argon या नाइट्रोजन गैस की एक धारा के तहत विलायक लुप्त हो जाना. दो घंटे के लिए एक निर्वात desiccator में टेस्ट ट्यूब को छोड़ कर शेष विलायक निकालें.
- HNE बफर के 400 microliters (5 मिमी HEPES, 145 मिमी NaCl, 0.1 मिमी EDTA) में सूखे लिपिड फिल्म Resuspend.
- एक प्लास्टिक की microcentrifuge ट्यूब के निलंबन स्थानांतरण. एक तरल नाइट्रोजन और एक गर्म पानी के स्नान में स्नान पिघलना में निलंबन रुक. इस चक्र / फ्रीज पिघलना चार बार दोहराएँ.
- एक 100 एनएम polycarbonate झिल्ली फिल्टर के साथ एक लिपिड extruder इकट्ठा, और लिपिड निलंबन 25 बार हटा. निलंबन को बाहर निकालना के बाद और अधिक पारदर्शी होना प्रकट करना चाहिए.
- Liposomes दिन वे तैयार कर रहे हैं पर किया जाना चाहिए. वे कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है जब तक इस्तेमाल किया.
Microfluidic प्रवाह सेल तैयारी
एक साधारण microfluidic प्रवाह कक्ष के बीच एक क्वार्ट्ज स्लाइड और एक functionalized coverslip डबल छड़ी टेप sandwiching द्वारा बनाई गई है.
- एक 20x20x3 मिमी क्वार्ट्ज स्लाइड प्राप्त करते हैं. एक हीरे की गड़गड़ाहट का प्रयोग दो विपरीत पक्षों पर 1 मिमी छेद ड्रिल.
- डबल छड़ी टेप के एक पत्रक से एक 20 मिमी वर्ग काटें, और एक रेजर ब्लेड का उपयोग करने के लिए, केंद्र से एक 15 x 2 मिमी अनुभाग में कटौती.
- पील टेप समर्थन के एक तरफ, और चौथाई गेलन करने के लिए टेप पालन बंदz स्लाइड. दूसरी तरफ एक functionalized coverslip पालन करें.
- दो polyethylene टयूबिंग की 20 सेमी लंबाई कट और उन्हें क्वार्ट्ज स्लाइड में छेद में डालने.
- 5 मिनट epoxy गोंद के साथ प्रवाह सेल सील.
- जब गोंद ठीक है, प्रधानमंत्री प्रवाह और बफर के साथ सेल टयूबिंग.
- एक समर्थित लिपिड bilayer चैनलों में liposome निलंबन के लगभग 80 microliters ड्राइंग द्वारा इस स्तर पर गठित किया जा सकता है.
वायरस कण लेबलिंग
- H3N2 इन्फ्लूएंजा ए (एक्स 31) आम तौर पर संलयन परख के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन अन्य फ्लू उपभेदों और अन्य वायरस को सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है.
- वायरस के साथ लेबल है दो अलग अलग फ्लोरोसेंट रंजक hemifusion और ताकना गठन का पता लगाने की अनुमति करने के लिए.
- HNE बफर में sulforhodamine ख (SRB) भंग करने के लिए एक 20 मिमी समाधान बनाने. वायरल निलंबन के 10 microliters के साथ डाई समाधान के 20 microliters का मिश्रण है, और 20 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें. इस अवधि के दौरान, डाई धीरे वायरस कणों के अंदर जमा करेंगे.
- एक PD-10 desalting स्तंभ के माध्यम से वायरस के निलंबन से गुजर रहा अतिरिक्त डाई निकालें. यदि पर्याप्त वायरल सामग्री का प्रयोग किया जाता है, एक रंग का बैंड स्तंभ में देखा जा सकता है. इस बैंड लेबल वायरस होते हैं और के रूप में यह eluted है एकत्र की जा सकती है.
- अगर कोई बैंड नहीं दिखाई है, 200 microliter भिन्न इकट्ठा करने और निर्धारित भिन्न जो वायरस एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर 565 एनएम अवशोषण को मापने के द्वारा लेबल होते हैं. वायरस लगभग 0.8 मिलीलीटर की कुल मात्रा में elute चाहिए.
- SRB लेबल वायरस निलंबन के लिए एक 2 मिमी डाइमिथाइल (DMF) octadecyl 110 rhodamine (Rh110C18) के formamide समाधान के 13 microliters जोड़कर वायरल लिफाफा लेबल.
- एक प्रयोगशाला अंग को घुमानेवाली पेशी ट्यूब संलग्न द्वारा निलंबन हिलाओ और 3 घंटे के लिए छोड़ दें.
- एक PD-10 desalting स्तंभ के रूप में पहले वर्णित का उपयोग कर अतिरिक्त Rh110C18 से वायरस शुद्ध.
माइक्रोस्कोप विन्यास
एक प्रतिदीप्ति एक उच्च एनए तेल विसर्जन कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए उपयुक्त उद्देश्य के साथ सुसज्जित खुर्दबीन पर प्रयोग किया जाता है. 488 और 568 / आर्गन क्रीप्टोण गैस लेजर से एनएम लाइनों Rh110C18 और SRB लेबल वायरस उत्तेजित करने के लिए उपयोग किया जाता है. प्रत्येक लेबल के साथ - साथ इमेजिंग एक dichroic दर्पण के साथ हरे और लाल प्रतिदीप्ति उत्सर्जन बंटवारे के द्वारा पूरा किया है और स्वतंत्र रूप से एक इलेक्ट्रॉन गुणा सीसीडी कैमरे के अलग आधा पर छवियों को ध्यान केंद्रित.
परख प्रदर्शन
संलयन परख के निष्पादन के प्रवाह कक्ष के भीतर एक जैव रासायनिक घटकों के stepwise विधानसभा के शामिल है: planar लिपिड bilayer के विधानसभा, लेबल वायरस कणों, fluorescein साथ सतह कोटिंग, और कम pH बफर (चित्रा 1 ए) के साथ प्रतिक्रिया की दीक्षा के डॉकिंग .
- प्रवाह सेल खुर्दबीन मंच पर माउंट, और एक सिरिंज के लिए प्रति मिनट 40 microliters की दर में प्रवाह करने के लिए सेट पंप आउटलेट टयूबिंग देते हैं.
- HNE के 300 microliters में बह द्वारा अतिरिक्त liposomes के प्रवाह चैनल रिक्त करें.
- खुर्दबीन फोकस और लेसर शक्ति को समायोजित करने के लिए 350 डब्ल्यू / सेमी 2 488 एनएम प्रकाश और 70 डब्ल्यू / सेमी 2 568 एनएम के प्रकाश के साथ सतह रोशन . यदि आप 1.45 एनए 60x तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग कर रहे हैं, 100 माइक्रो वाट और 20 माइक्रो वाट लेजर तीव्रता क्रमशः सेट,.
- पम्प एक प्रवाह कक्ष में लेबल वायरस (1 / 100 पतला). के रूप में वायरस प्रवाह चैनल के नीचे की सतह के लिए diffuses, कण ganglioside लिपिड bilayer में शामिल करने के लिए छड़ी करने के लिए शुरू हो जाएगा.
- जब डॉक्ड वायरस कणों का एक उपयुक्त घनत्व प्राप्त किया गया है (देखने के क्षेत्र के अनुसार 1000 के आसपास कणों के लिए). स्विच एक प्रति मिली लीटर fluorescein लेबल streptavidin के दो micrograms युक्त समाधान के लिए प्रवेश टयूबिंग. लेबल streptavidin bilayer में लिपिड अणु मिलकर बायोटिन बाध्य है, और अंततः एक मंद हरे रंग की पृष्ठभूमि दिखाई जाएगी.
- HNE के 300 microliters के साथ प्रवाह चैनल धो लें.
- एक इमेजिंग क्षेत्र चुनें, खुर्दबीन ध्यान केंद्रित करने और समय व्यपगत छवि अधिग्रहण के लिए सीसीडी कैमरा तैयार. 100 एमएस के लिए जोखिम के समय सेट और 10 हर्ट्ज की एक दर पर फ्रेम इकट्ठा.
- एक अम्लीय बफर में 10 मिमी सोडियम साइट्रेट और 140 मिमी NaCl युक्त बह संलयन आरंभ करें. बफर के पीएच को नीचे जा रहा है assayed वायरस के महत्वपूर्ण पीएच समायोजित किया जाना चाहिए. पीएच में एक्स-31 फ़्यूज़ नीचे 5.5.
प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1 बी संलयन से पहले और दौरान bilayer डॉक्ड virions की फोटो से पता चलता है. प्रत्येक विवर्तन सीमित जगह एक व्यक्ति वायरस कण का प्रतिनिधित्व करता है. लाल और हरे रंग प्रतिदीप्ति अलग किया गया है एक सीसीडी कैमरे के ऊपर और नीचे आधा पर imaged, वायरल लिफाफा और सामग्री लेबल के साथ - साथ प्रेक्षण की अनुमति. वहां आम तौर पर कर रहे हैं की तुलना में दो बार के रूप में कई हरे चैनल में स्पॉटलाल, और इस सामग्री डाई कम लेबलिंग लिफाफा लेबल की तुलना में दक्षता को दर्शाता है. हरे रंग की पृष्ठभूमि सतह से उत्सर्जित प्रतिदीप्ति fluorescein बाध्य साइट्रेट बफर के आगमन पर गायब हो जाता है और संलयन प्रतिक्रिया का प्रारंभ समय के निर्धारण की अनुमति देता है. Hemifusion घटनाओं हरी प्रतिदीप्ति के फटने के रूप में hemifusion डंठल भर में वायरल लिफाफा diffuses में बुझती Rh110C18 रूप में पता चला रहे हैं और planar झिल्ली में पतला है. एक जावक विस्तार फ्लोरोसेंट बादल hemifused कणों के आसपास देखा जा सकता है, फैटी एसाइल planar झिल्ली में जुड़ा हुआ डाई से मुक्त प्रसार का प्रदर्शन. ताकना गठन वायरल कणों के इंटीरियर के भीतर फंसे SRB से लाल प्रतिदीप्ति के क्षय के रूप में मनाया जाता है. एक संलयन ताकना के उद्घाटन डाई bilayer planar और अवलोकन क्षेत्र के बाहर के नीचे जलीय अंतरिक्ष में से बचने के लिए अनुमति देता है.
प्रत्येक कण के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता trajectories, व्यक्तिगत कणों के एकीकृत तीव्रता से प्लॉट किए जाते हैं, hemifusion और ताकना गठन (छवि 1C) की उपज और समय के निर्धारण की सुविधा. Hemifusion और ताकना गठन घटना बार बिंदु है जिस पर एक Rh110C18 प्रतिदीप्ति फट या SRB संकेत क्षय की अधिकतम ढलान होता है के रूप में निर्धारित कर रहे हैं. एक सफल प्रयोग में, Rh110C18 उपज dequenching का संकेत है, और SRB लेबल कणों के 30 प्रतिशत के साथ लेबल कणों के बारे में 50 प्रतिशत useable के संकेत दे. दोनों रंगों के साथ लेबल कणों, लगभग 10 प्रतिशत दोनों लिपिड मिश्रण और ताकना गठन संकेतों दिखा.
चित्र 2A सी hemifusion और ताकना गठन अंतराल समय के एक ठेठ प्रयोग से वितरण से पता चलता है. Fig.2D एफ पांच एक ही परिस्थितियों में प्रदर्शन प्रयोगों से संयुक्त घटनाओं की घटना वितरण से पता चलता है. टिप्पणियों का एक मामूली संख्या के साथ भी, histograms के आकार स्पष्ट है. क्योंकि प्रत्येक प्रयोग पीएच ड्रॉप समय का पता लगाने के द्वारा सिंक्रनाइज़ है, कई प्रयोगों और संयुक्त किया जा सकता है मध्यवर्ती कदम सीमित दर के बारे में विस्तृत जानकारी प्राप्त की जा सकती है.
1 चित्रा प्रायोगिक डिजाइन. ए) वायरस कणों दो फ्लोरोसेंट रंजक के साथ लेबल रहे हैं hemifusion और संलयन ताकना गठन के कैनेटीक्स की निगरानी. प्रतिदीप्ति एक खुर्दबीन उच्च एनए उद्देश्य से एकत्र की है और एक सीसीडी पर imaged. बी) (बाएं) से पहले और दौरान प्रतिदीप्ति छवियों (दाएं) व्यक्तिगत वायरल कणों के संलयन. प्रत्येक छवि के ऊपर और नीचे आधा लाल और हरे रंग प्रतिदीप्ति के अनुरूप है, क्रमशः समर्थित bilayer की इसी ~ x 100 मिमी 2 50 क्षेत्र के, . सी) लाल SRB वायरल सामग्री अनुरेखक (ऊपरी ट्रेस) की प्रतिदीप्ति तीव्रता, हरी Rh110C18 झिल्ली (मध्य ट्रेस) डाई, और fluorescein पीएच सेंसर (कम ट्रेस) सटीक पीएच ड्रॉप, hemifusion, और संलयन के बीच बीता समय प्रदान करते हैं. कृपया यहाँ क्लिक करें संख्या 1 के एक बड़ा संस्करण देख.
चित्रा 2 fluorescently लेबल वायरस के फ्यूजन कैनेटीक्स. पीएच ड्रॉप और hemifusion (ए, डी) और ताकना गठन (बी, ई) के बीच elapsed समय के वितरण. और वितरण की वृद्धि और क्षय कई मध्यवर्ती कदम की उपस्थिति का संकेत है. hemifusion और व्यक्ति के कणों के लिए एक संलयन ताकना के उद्घाटन के बीच संक्रमण तेजी से वितरित किया जाता है एक कदम दर सीमित सुझाव. पैनलों एसी एक एकल प्रयोग के परिणाम बताते हैं. पैनलों लोमो पांच अलग ही परिस्थितियों में प्रदर्शन प्रयोगों से संकलित कर रहे हैं. कृपया यहाँ क्लिक करें आंकड़ा 2 का एक बड़ा संस्करण देख.
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Discussion
तरल पदार्थ और सतत समर्थित लिपिड bilayers की तैयारी चुनौतीपूर्ण हो सकता है. सामग्री या सतह दोष contaminating के ट्रेस मात्रा bilayers के प्रसार को रोकने जाएगा. सावधानी से सफाई और dextran के एक समान परत के बयान के लिए आवश्यक हैं.
वायरस कणों का लम्बे समय तक इमेजिंग फ्लोरोसेंट लेबल ब्लीच या उन्हें निष्क्रिय बनने के लिए कारण सकता है. जैव इमेजिंग और एक अणु क्षेत्रों में इस तरह के फोटो क्षति अच्छी तरह से जाना जाता है और आम तौर पर उत्साहित fluorophores द्वारा प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की पीढ़ी से स्टेम माना है. तस्वीर क्षति को कम करने के लिए, हम आम तौर पर उत्तेजना लेसर शक्ति को कम करने और प्रयोग शुरू करने से पहले लंबे समय तक जोखिम से बचने. कई ऑक्सीजन सफाई रिपोर्ट प्रणालियों के साथ buffers से ऑक्सीजन की कमी उपयोगी साबित हो सकता है है.
क्षणिक मध्यवर्ती राज्यों के बारे में जानकारी प्राप्त करने की क्षमता की आवश्यकता है कि संलयन प्रतिक्रिया ठीक सिंक्रनाइज़ हो. प्रवाह दर और इनलेट टयूबिंग और प्रवाह सेल चैनल के मृत मात्रा कारक है कि तुल्यकालन को सीमित कर सकते हैं कर रहे हैं. फ्यूजन अम्लीय pH बफर के लिए तटस्थ आदान प्रदान द्वारा शुरू की है. हालांकि, अम्लीय बफर के रूप में प्रवाह सेल में प्रवेश टयूबिंग के माध्यम से यात्रा, दो buffers के बीच इंटरफेस प्रसार के माध्यम से घोला जा सकता है और उत्तरोत्तर कम अच्छी तरह से परिभाषित हो जाता है. परिणामस्वरूप bilayer सतह पर पीएच ढाल करने के लिए शुरू समय का निर्धारण धुंधला जाता है. इसके अलावा, के बाद से संलयन कैनेटीक्स प्रोटॉन एकाग्रता पर निर्भर है, प्रयोग के शुरू में एक पीएच ढाल परिणामों की व्याख्या के जटिल हो सकता है. प्रयोग यहाँ प्रदर्शन में, संलयन के कैनेटीक्स पीएच संक्रमण समय की तुलना में धीमी है, और ढाल प्रभाव काफी संलयन कैनेटीक्स को प्रभावित नहीं करता है. हम वर्तमान में हमारे प्रवाह कोशिकाओं को संशोधनों है कि हमें वांछित बफर के साथ प्रवाह सेल में प्रवाह मनोविनोद पहले प्रवेश टयूबिंग प्रधानमंत्री के लिए अनुमति होगी पर काम कर रहे हैं.
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Acknowledgments
काम NIH अनुदान (SCH के लिए) AI57159 और AI72346 (AMvO के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था. SCH एक हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट अन्वेषक है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning cover glass squares, 25 mm | Sigma-Aldrich | CLS286525 | |
| Fused silica slides | Technical Glass | ||
| Staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| (3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane | Gelest Inc. | SIG5840.1 | |
| Dextran T-500 | Pharmacosmos | 5510 0500 4006 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850375 | |
| 1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850457 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipid, Inc | 700000 | |
| N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE) | Invitrogen | B1616 | |
| Streptavidin, fluorescein conjugate | Invitrogen | S-869 | |
| Disialoganglioside GD1a from bovine brain | Sigma-Aldrich | G2392 | |
| Mini Extruder | Avanti Polar Lipid, Inc | 610000 | |
| 0.1 micron polycarbonate membrane filters | Whatman, GE Healthcare | 800309 | |
| 10 mm drain discs (membrane supports) | Whatman, GE Healthcare | 230300 | |
| Sulforhodamine b sodium salt | S1402 | ||
| Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18) | See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol | ||
| PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Nikon fluorescence microscope | Nikon Instruments | TE2000-U | |
| Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective | Nikon Instruments | ||
| Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser | Coherent Inc. | ||
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702213 |
References
- Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers. Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).
- Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).
