Summary
אנו מציגים
Abstract
היתוך ממברנה היא מהווה נדבך חיוני במהלך כניסה של וירוסים עטופים לתוך התאים. מבחני היתוך קונבנציונלי בדרך כלל לדווח על מספר רב של אירועים היתוך, ולכן קשה לנתח באופן כמותי את רצף הפעולות המולקולריים המעורבים. פיתחנו במבחנה, שני צבעים assay הקרינה לפקח קינטיקה של פיוזינג חלקיקי נגיף יחיד עם bilayer היעד על תמיכה נוזל בעיקרו.
חלקיקים שפעת נגיפית מודגרת עם fluorophore lipophilic ירוק להכתים את הממברנה fluorophore הידרופילי אדום להכתים את פנים ויראלי. אנו פיקדון bilayer ganglioside המכילים שומנים על פני השטח dextran-functionilized הזכוכית של התא זרימה, דגירה חלקיקים נגיפיים על bilayer את התמונה מישוריים את הקרינה של 100 x 100 מיקרומטר אזור 2, המכיל כמה מאות של חלקיקים, על CCD המצלמה. על ידי הדמיה הן פלואורסצנטי אדום וירוק, אנחנו יכולים בו זמנית לפקח על התנהגותם של לצבוע את הממברנה (ירוק) לבין תוכן מימית (אדום) של חלקיקים.
לאחר הפחתת ה-pH מתחת לערך pH המיזוג, חלקיקים יהיה הפתיל עם הממברנה. Hemifusion, מיזוג של עלון החיצוני של קרום ויראלי עם עלון החיצוני של קרום היעד, יהיה גלוי כשינוי פתאומי פלואורסצנטי ירוק של חלקיק. עם היתוך הבאים של שני כרוזים דיסטלי הנותרים נקבוביות תוקם ואת fluorophore אדום פולטות חלקיק נגיפי ישוחררו תחת קרום היעד. אירוע זה יהיה להצמיח ירידה של הקרינה האדום של חלקיקים בודדים. לבסוף, פלואורסצנציה משולב מ fluorophore pH רגיש המוטבע קרום היעד מדווחת על הזמן המדויק של ירידה ה-pH.
מתוך שלושת זמן פלואורסצנציה-עקבות, את כל האירועים החשובים (ירידה pH, שומנים ערבוב על תוכן hemifusion, ערבוב על היווצרות נקבוביות) כעת ניתן לחלץ בצורה ישירה עבור כל חלקיק בנפרד. על ידי איסוף פעמים שחלף על מעברים שונים עבור חלקיקים בודדים רבים היסטוגרמות, אנו יכולים לקבוע את תקופות חיים של ביניים המקביל. אפילו ביניים נסתרים אין הנצפה פלורסנט ישיר ניתן דמיינו ישירות היסטוגרמות אלו.
Protocol
להחליק זכוכית לכסות functionalization
Bilayer מישוריים המשמשים assay היתוך נתמך על סרט hydrated של dextran. Dextran מעשים כשומר רווח בין bilayer מישוריים משטח זכוכית. זה מונע מרכיבי קרום מלהיות תקוע על משטח זכוכית מספק גם מקום שבו התוכן של חלקיק וירוס יכול להימלט על היתוך. Coverslips זכוכית הן פונקציונליות דרך הטיפול עם אפוקסי silane, אשר מאפשר לנו כימית האג"ח dextran על זכוכית (Elender, et al. 1996).
- סדר coverslips 25 מ"מ במעמד מכתים קרמיקה, והמקום מתלה לתוך צנצנת או כוס.
- מלאו את המיכל עם פתרון 10% חומר ניקוי זכוכית מעבדה כיתה. הנח את המיכל נקי קולי במשך 30 דקות.
- שטפו את מיכל המים עם מתלה coverslip deionized, ולמלא עם הידרוקסיד postassium 1M. החזר את מיכל sonicator האמבטיה לעוד 30 דקות.
- חזור על נוהל זה ניקוי באמצעות אצטון ואתנול.
- שוטפים את coverlips במים ויבש.
- לבסוף, לנקות את coverslips עם חשפנית חמצן פלזמה במשך שלוש דקות.
- השלב האחרון oxidizes ניקוי פני השטח, מה שהופך את הזכוכית הידרופילי אחיד תגובתי בשלבים silanization הבאה.
- הכן פתרון 0.2% של 3-glycidoxypropyltrimethoxy silane ב isopropanol. לטבול את coverslips בפתרון זה למשך חמש דקות.
- מחק את הפתרון silane ולשטוף מספר פעמים coverslips ב isopropanol.
- Coverslips הם מצופה כעת בשכבת silane, אבל הם חייבים להירפא לאפשר silane להיקשר קוולנטית אל הזכוכית. מניחים את coverslips בתנור להגדיר עד 80 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
- בעוד coverslips הם ריפוי, לשקול את dextran 500 ולהכין 30% w / v פתרון. Preheating המים יסייעו פירוק. אנו נשתמש בערך 1 מ"ל של פתרון זה לכל coverslip. לאחר dextran נמס, defoam את הפתרון ייבוש ואקום.
- כאשר coverslips silanized סיימו ריפוי, להסיר אותם מן המדף קרמיקה ומסדרים אותם שטוח על החלק הפנימי של קופסת פלסטיק במקפיא. השתמש פיפטה 1 מ"ל על מנת לכסות את המשטח העליון של כל עם coverslip ~ 1 מ"ל של התמיסה dextran. סגור את תיבת הקפאה להשאיר במקום שקט במשך 24-36 שעות.
- בעוד לתפוס את coverslips עם מלקחיים פלסטיק, לשפוך את עודפי dextran ולהחליף אותם למעמד חרס. יש לשטוף מספר פעמים coverslips במים, ולאפשר coverslips כדי להשרות במים למשך 48 שעות. צנצנת יכול להיות נסער בעדינות על הכתף שולחן העליון.
- יבש coverslips בתנור להגדיר עד 80 מעלות צלזיוס חנות ייבוש ואקום.
Liposome הכנה
Bilayers השומנים נתמכים נוצרות על ידי adsorbing ליפוזומים כדי coverslip dextran פונקציונליות. ליפוזומים adsorbed הפתיל עם eachother עד הקרום נקרע ומתפשט שטוח על פני השטח.
- ניסוח liposome אופייני בשימוש assay מורכב 1,2, dioleoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1-oleoyl-2-palmitoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (POPC), כולסטרול, המוח שור Disialoganglioside (GD 1a), ו-N ((6 - (biotinoyl) אמינו) hexanoyl) -1,2-dihexadecanoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamine יחס של 4:4:2:0.1:5 x10 -5. כל הרכיבים מאוחסנים כלורופורם או כלורופורם ופתרונות מתנול.
- הכן תערובת המכילה שני micromoles של שומנים בדם על ידי העברת כרכים של כל רכיב לתוך מבחנה זכוכית. להתאדות הממס תחת זרם של ארגון או גז חנקן. הסר את הממס הנותרים על ידי השארת את המבחנה בתוך תא ייבוש ואקום במשך שעתיים.
- Resuspend הסרט השומנים מיובשים 400 מיקרוליטר של חיץ HNE (5 HEPES מ"מ, 145 mM NaCl, 0.1 mM EDTA).
- מעבירים את ההשעיה לצינור microcentrifuge פלסטיק. להקפיא את ההשעיה באמבט חנקן נוזלי ההפשרה באמבט מים חמים. חזור על מחזור ההקפאה / הפשרה ארבע פעמים.
- להרכיב extruder השומנים עם 100 ננומטר פוליקרבונט הממברנה לסנן, ו extrude ההשעיה שומנים 25 פעמים. ההשעיה צריך להיראות שקוף יותר אחרי שחול.
- ליפוזומים אמור לשמש ביום שהם מוכנים. הם עשויים להיות מאוחסן בטמפרטורת החדר עד בשימוש.
תזרים Microfluidic תא הכנה
תא פשוט לזרום microfluidic נעשית על ידי הרבדה קלטת מקל כפול בין שקופית קוורץ coverslip פונקציונליות.
- השג שקופיות 20x20x3 מ"מ קוורץ. השתמש בר יהלום לקדוח שתי חורים 1 מ"מ משני צדי המתרס.
- גזור ריבוע 20 מ"מ מסדין של קלטת מקל כפול, באמצעות סכין גילוח, לגזור 15 x 2 סעיף מ"מ מהמרכז.
- קולפים את צד אחד של גיבוי קלטת, לדבוק את הקלטת ליטרz שקופיות. ציית את הצד השני כדי coverslip פונקציונליות.
- לחתוך שתי באורכים 20 ס"מ של צינורות פוליאתילן ולהכניס אותם לתוך החורים לשקופית קוורץ.
- חותם התא זרימה עם דבק אפוקסי 5 דקות.
- כאשר הדבק ריפא, תא הממשלה הזרימה בצינור עם חיץ.
- Bilayer השומנים נתמך יכול להיווצר בשלב זה על ידי ציור כ -80 מיקרוליטר של ההשעיה liposome לתוך הערוצים.
חלקיק וירוס תיוג
- שפעת H3N2 (X-31) משמש בדרך כלל עבור assay המיזוג, אך זני שפעת אחרים ווירוסים אחרים שימשו בהצלחה.
- וירוס מסומן עם עד שני צבעי ניאון שונה על מנת לאפשר זיהוי של hemifusion ואת היווצרות נקבוביות.
- ממיסים sulforhodamine ב (SRB) במאגר HNE לעשות פתרון 20 מ"מ. שלב 20 מיקרוליטר של הפתרון לצבוע עם 10 מיקרוליטר של ההשעיה ויראלי, ומשאירים בטמפרטורת החדר למשך 20 שעות. במהלך תקופה זו, צבען יהיה לאט לצבור בתוך חלקיקי הנגיף.
- הסר את עודפי צבע על ידי העברת ההשעיה וירוס דרך עמודה PD-10 desalting. אם החומר מספיק ויראלי משמש, להקה צבעונית ניתן לראות בעמודה. להקה זו מכילה וירוס שכותרתו ניתן לאסוף כפי שהוא eluted.
- אם הלהקה לא גלוי, לאסוף 200 שברים microliter ולקבוע אילו שברים להכיל וירוס הנקרא על ידי מדידת ספיגת 565 ננומטר על ספקטרופוטומטר. הווירוס צריך elute בהיקף כולל של כ 0.8 מ"ל.
- לייבל את המעטפה ויראלי ידי הוספת 13 מיקרוליטר של לפוראמיד דימתיל 2 מ"מ (DMF) פתרון של octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18) כדי ההשעיה SRB שכותרתו וירוס.
- מערבבים את ההשעיה על ידי הצמדת הצינורית אל הכתף מעבדה ולהשאיר למשך 3 שעות.
- לטהר את הנגיף Rh110C18 עודף באמצעות PD-10 טור desalting כפי שתואר קודם.
מיקרוסקופ תצורה
הניסוי מתבצע על מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד מטרה גבוהה שמן NA טבילה מתאים הכולל מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית. 488 ו - 568 קווי ננומטר של ארגון / גז קריפטון לייזר משמשים כדי לעורר את הוירוס Rh110C18 ו SRB שכותרתו. הדמיה סימולטני של כל תווית נעשה על ידי פיצול פליטת הקרינה ירוק ואדום עם מראה dichroic עצמאי התמקדות את התמונות על גבי חצאים נפרדים של מצלמת CCD הכפלת אלקטרונים.
ביצוע Assay
ביצוע של assay היתוך כרוך הרכבה בשלבים של רכיבים ביוכימיים בתוך התא זרימה: הרכבה של bilayer השומנים מישוריים, עגינה של חלקיקי נגיף הנקרא, ציפוי משטח עם והעמסת, וכן ייזום תגובה עם חיץ pH נמוך (איור 1A) .
- הר את זרימת תאים לבמה מיקרוסקופ, ולצרף את צינור מוצא לשאוב מזרק להגדיר לזרום בקצב של 40 מיקרוליטר לדקה.
- נקה את ערוצי הזרימה של ליפוזומים עודף ידי זורם 300 מיקרוליטר של HNE.
- פוקוס מיקרוסקופ ולהתאים את כוח לייזר כדי להאיר את פני השטח עם 2 350 W / ס"מ של אור 488 ננומטר 70 W / cm 2 של אור 568 ננומטר. אם אתה משתמש ב 1.45 NA 60x טבילה אובייקטיבי שמן, לקבוע את עוצמות לייזר עד 100 וואט מיקרו 20 מיקרו וואט, בהתאמה.
- משאבה וירוס הנקרא (בדילול מלא 1 / 100) לתוך התא זרימה. כאשר הנגיף מפזרת על פני השטח התחתון של ערוץ זרימה, חלקיקים יתחילו לדבוק ganglioside שולבו bilayer השומנים.
- כאשר צפיפות מתאים של חלקיקי נגיף עגנה שהושגה (עד סביב 1000 חלקיקים לכל שדה הראיה). החלף את צינור היניקה לפתרון המכיל שני מיקרוגרם למיליליטר streptavidin והעמסת שכותרתו. Streptavidin שכותרתו יהיה לאגד ביוטין מולקולות השומנים בשילוב ב bilayer, ובסופו של דבר רקע ירוק עמום יהיה גלוי.
- לשטוף את הערוץ לזרום עם 300 מיקרוליטר של HNE.
- בחר אזור הדמיה, למקד את המיקרוסקופ ולהכין את מצלמת CCD לרכישת זמן שפקע התמונה. קבע את זמן החשיפה 100 ms ולאסוף מסגרות בקצב של 10 הרץ.
- יזום על ידי היתוך זורם חיץ חומצי המכיל נתרן 10 mM ציטראט 140 mM NaCl. ה-pH של המאגר צריך להיות מותאם להיות מתחת pH הקריטי של הנגיף להיות assayed. X-31 נתיכים ב-pH של 5.5 להלן.
נציג תוצאות
1B איור מראה תמונות של virions עגנה bilayer לפני ובמהלך היתוך. כל נקודה עקיפה מוגבל מייצג חלקיק נגיף יחיד. האדום והירוק הקרינה כבר צילמו בנפרד על גבי חצאים העליון והתחתון של מצלמה CCD, המאפשר תצפית סימולטני של המעטפה ויראלי ותוויות תוכן. יש בדרך כלל נקודות כפליים בערוץ ירוק לעומתהאדומים, והדבר משקף את יעילות נמוכה יותר של תיוג על ידי לצבוע את התוכן לעומת תווית את המעטפה. הקרינה רקע ירוק הנפלטים מפני השטח מחויב והעמסת נעלמת עם הגעתו של למאגר ציטראט ומאפשר קביעת מועד ההתחלה של התגובה היתוך. אירועים Hemifusion מזוהים כמו פרצי הקרינה ירוק כמו Rh110C18 הרווה את מפזרת על פני מעטפת נגיפיים גבעול hemifusion והוא מדולל בקרום מישוריים. ענן החוצה פלורסנט הרחבת ניתן לראות סביב חלקיקים hemifused, הוכחת דיפוזיה חופשית של צבע שומן acyl המקושר בקרום מישוריים. היווצרות נקבובית הוא ציין גם הדעיכה של הקרינה אדום SRB לכוד בתוך הפנים של חלקיקים נגיפיים. פתיחת הנקבוביות היתוך מאפשר לצבוע לברוח לחלל מימית מתחת bilayer החוצה מישוריים באזור התצפית.
מסלולי עוצמת הקרינה של כל חלקיק, זממו מן בעוצמות משולבת של חלקיקים בודדים, להקל על קביעת התשואה והשעות של hemifusion היווצרות נקבוביות (איור 1C). Hemifusion היווצרות נקבוביות פעמים האירוע נקבעים הנקודה שבה השיפוע המרבי של פרץ Rh110C18 פלואורסצנטי או ריקבון SRB האות מתרחשת. בניסוי מוצלח, על 50 אחוזים של חלקיקים שכותרתו עם Rh110C18 dequenching אותות תשואה, ו -30 אחוזים של חלקיקים SRB שכותרתו לתת אות שמיש. של חלקיקי שכותרתו עם שני צבעים, כ -10 אחוזים להראות השומנים הן אותות ערבוב היווצרות נקבוביות.
איור. 2A-C מציג את התפלגות hemifusion היווצרות נקבוביות פעמים בפיגור מניסוי טיפוסי. Fig.2D-F מראה הפצות במקרה של אירועים יחד מתוך חמישה ניסויים שבוצעו באותם תנאים. אפילו עם מספר צנוע של תצפיות, את הצורה של היסטוגרמות ניכר. כי כל ניסוי מסונכרן על ידי זיהוי של זמן הירידה pH, ניסויים רבים ניתן לשלב ומידע מפורט על שיעור הגבלת צעדים ביניים ניתן להשיג.
באיור 1. עיצוב ניסיוני. א) חלקיקי וירוסים מסומנים עם שני צבעי ניאון כדי לפקח על קינטיקה של hemifusion ואת היווצרות נקבוביות היתוך. Fluorescence נאסף על ידי אובייקטיבי גבוהה NA מיקרוסקופ הדמיה על גבי ה-CCD. ב) תמונות Fluorescence לפני (משמאל) במהלך (מימין) היתוך של חלקיקים נגיפיים בודדים. החצי העליון והתחתון של כל תמונה מתאימות הקרינה אדום וירוק, בהתאמה, של האזור ~ 50 x 100 מ"מ 2 באותו bilayer תמכו. ג) עוצמת הקרינה של נותב אדום SRB תוכן ויראלי (זכר העליון), הירוק Rh110C18 קרום צבען (באמצע זכר), ואת חיישן pH והעמסת (זכר התחתון) לספק הזמנים המדויק שחלף בין ירידה pH, hemifusion, ואיחוי. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1.
איור 2. קינטיקה Fusion של הנגיף שכותרתו fluorescently. הפצות הזמן שחלף בין הירידה pH ו hemifusion (A, D) היווצרות נקבוביות (B, E). עליית וריקבון של הפצות להעיד על נוכחות של צעדים ביניים מרובות. המעבר בין hemifusion ופתיחת נקבוביות היתוך עבור חלקיקים בודדים מופץ באופן אקספוננציאלי, דבר המצביע על צעד יחיד שער הגבלת. לוחות AC להראות את תוצאות הניסוי יחיד. DF לוחות מופקים מתוך חמישה ניסויים נפרדים שבוצעו באותם תנאים. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הכנת נוזל רציפה bilayers השומנים נתמך יכול להיות מאתגר. כמויות זעירות של חומר מזהם פגמים או משטח תמנע הפצת bilayers. בתצהיר ניקוי זהיר של שכבה אחידה של dextran חיוניים.
הדמיה ממושכת של חלקיקי הנגיף יכול להלבין את תוויות ניאון או לגרום להם להיות מובטל. Photo-נזק מסוג זה ידוע היטב ביו הדמיה שדות מולקולה בודדת הוא האמין בדרך כלל נובעות הדור של מינים החמצן מגיב על ידי fluorophores נרגש. כדי למזער את הנזק צילום, אנחנו בדרך כלל למזער את כוח לייזר עירור ולהימנע מחשיפה ממושכת לפני תחילת הניסוי. דלדול של חמצן מן מאגרים עם אחת ממערכות חמצן כמה הדחה דיווח עשוי להיות שימושי.
היכולת לקבל מידע על זמני ביניים המדינות מחייב את תגובת היתוך להיות מסונכרנים בדיוק. קצב זרימת משומשים נפח המתים של צינורות היניקה ותא ערוץ זרימה הם גורמים שיכולים להגביל סנכרון. פיוז'ן הוא יזם ידי החלפת ה-pH ניטרלי חוצץ חומצי. עם זאת, כפי החיץ חומצי עובר צינור היניקה לתוך התא זרימה, הממשק בין שני מאגרים מתערבב דרך דיפוזיה הופך בהדרגה פחות מוגדרים. ההדרגתיות של ה-pH שהתקבל על פני השטח bilayer נוטה לטשטש קביעת הזמן להתחיל. יתר על כן, מאז המיזוג הקינטיקה תלויה בריכוז פרוטון, שיפוע pH בתחילת הניסוי עלול לסבך את הפרשנות של התוצאות. בניסוי הראו כאן, קינטיקה של היתוך הוא איטי יותר מאשר זמן המעבר pH ועל ההשפעה שיפוע לא להשפיע באופן משמעותי על קינטיקה היתוך. כרגע אנחנו עובדים על שינויים בתאי תזרים שלנו יאפשר לנו ממשלה בצינור היניקה עם חיץ הרצוי לפני להסיט את הזרימה לתוך התא זרימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
העבודה נתמכה על ידי NIH מענקים AI57159 (עד SCH) ו AI72346 (עד AMvO). SCH הוא הווארד יוז חוקר רפואי במכון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning cover glass squares, 25 mm | Sigma-Aldrich | CLS286525 | |
| Fused silica slides | Technical Glass | ||
| Staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| (3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane | Gelest Inc. | SIG5840.1 | |
| Dextran T-500 | Pharmacosmos | 5510 0500 4006 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850375 | |
| 1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850457 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipid, Inc | 700000 | |
| N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE) | Invitrogen | B1616 | |
| Streptavidin, fluorescein conjugate | Invitrogen | S-869 | |
| Disialoganglioside GD1a from bovine brain | Sigma-Aldrich | G2392 | |
| Mini Extruder | Avanti Polar Lipid, Inc | 610000 | |
| 0.1 micron polycarbonate membrane filters | Whatman, GE Healthcare | 800309 | |
| 10 mm drain discs (membrane supports) | Whatman, GE Healthcare | 230300 | |
| Sulforhodamine b sodium salt | S1402 | ||
| Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18) | See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol | ||
| PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Nikon fluorescence microscope | Nikon Instruments | TE2000-U | |
| Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective | Nikon Instruments | ||
| Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser | Coherent Inc. | ||
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702213 |
References
- Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers. Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).
- Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).
