Summary
Vi presentiamo uno
Abstract
Fusione della membrana è un passo essenziale durante l'immissione di virus con involucro in cellule. Saggi di fusione convenzionale tipicamente rapporto su un gran numero di eventi di fusione, il che rende difficile analizzare quantitativamente la sequenza delle fasi molecolari coinvolti. Abbiamo sviluppato un in vitro, a due colori saggio a fluorescenza per monitorare la cinetica di fusione singole particelle virali con un doppio strato obiettivo su un supporto essenzialmente fluido.
L'influenza delle particelle virali sono incubati con un fluoroforo verde lipofile di macchiare la membrana e un fluoroforo rosso idrofilo per colorare l'interno virale. Abbiamo un deposito gangliosidi contenenti doppio strato lipidico sul destrano-functionilized superficie di vetro di una cella a flusso, incubare le particelle virali nel doppio strato planare e l'immagine della fluorescenza di un x 100 100 micron 2 Superficie, contenente diverse centinaia di particelle, su un CCD fotocamera. Per immagini sia la fluorescenza rossa e verde, siamo in grado di monitorare contemporaneamente il comportamento del colorante membrana (verde) e il contenuto acquoso (rosso) delle particelle.
Su abbassando il pH ad un valore al di sotto del pH fusione, le particelle si fondono con la membrana. Hemifusion, la fusione dei foglietto esterno della membrana virale con il foglietto esterno della membrana bersaglio, sarà visibile come un cambiamento improvviso della fluorescenza verde di una particella. Al momento della fusione dei due successivi volantini rimasti distale un poro sarà formata e il rosso che emettono fluoroforo nella particella virale sarà rilasciato sotto la membrana di destinazione. Questo evento darà luogo ad una diminuzione della fluorescenza rossa delle singole particelle. Infine, la fluorescenza integrato da un pH-sensibile fluoroforo che è incorporato nella membrana di destinazione indica il momento esatto della caduta di pH.
Dai tre fluorescenza in tempo le tracce, tutti gli eventi importanti (calo del pH, lipidi miscelazione su hemifusion, i contenuti di miscelazione sulla formazione dei pori) possono ora essere estratte in modo diretto e per ogni particella singolarmente. Raccogliendo i tempi trascorsi per le transizioni diverse per molte singole particelle in istogrammi, possiamo determinare la durata degli intermedi corrispondenti. Anche intermedi nascosti che non hanno un diretto osservabile fluorescenti possono essere visualizzati direttamente da questi istogrammi.
Protocol
Vetro di copertura funzionalizzazione slittamento
Il doppio strato planare utilizzata nel test di fusione è supportato da un film idrati di destrano. Destrano funge da distanziatore tra il doppio strato planare e superficie di vetro. Questo impedisce che i componenti della membrana di diventare bloccato sulla superficie del vetro e fornisce anche lo spazio in cui il contenuto di una particella virale può sfuggire alla fusione. Coprioggetto di vetro sono funzionalizzati con il trattamento con una resina epossidica silano, che ci permette di legame chimico destrano al vetro (Elender, et al. 1996).
- Disporre 25 coprioggetto mm in un rack per colorazione ceramica, e posto il rack in un vaso o bicchiere.
- Riempire il contenitore con una soluzione al 10% di detersivo da laboratorio vetreria. Mettere il recipiente in un bagno ad ultrasuoni per 30 minuti.
- Sciacquare il contenitore e rack coprioggetto con acqua deionizzata, e riempire con idrossido postassium 1M. Restituire il contenitore per il bagno sonicatore per altri 30 minuti.
- Ripetere questa procedura di pulizia con acetone ed etanolo.
- Sciacquare il coverlips in acqua e asciugare.
- Infine, pulire il coprioggetto con una spogliarellista di ossigeno nel plasma per tre minuti.
- La fase di pulizia ultima ossida la superficie, rendendo il vetro in modo uniforme idrofila e reattiva nelle fasi silanizzazione seguenti.
- Preparare una soluzione allo 0,2% di 3-glycidoxypropyltrimethoxy silano in isopropanolo. Immergere i coprioggetti in questa soluzione per cinque minuti.
- Scartare la soluzione silano e risciacquare i tempi coprioggetto diverse in isopropanolo.
- I coprioggetti ora sono rivestiti con uno strato di silano, ma devono essere curate per consentire al silano a legarsi covalentemente al vetro. Posizionare il coprioggetto in forno a 80 gradi Celsius per un'ora.
- Mentre i coprioggetti sono stagionatura, pesare destrano 500 e preparare un 30% w / v soluzione. Preriscaldamento l'acqua facilitare la soluzione. Useremo circa 1 ml di questa soluzione per coprioggetto. Una volta che il destrano è sciolta, antischiuma la soluzione in un essiccatore a vuoto.
- Quando i coprioggetti silanizzata hanno finito la cura, rimuoverli dal rack ceramica e disporle sul piatto all'interno di una scatola di plastica congelatore. Usare una pipetta da 1 ml per coprire la superficie superiore di ogni coprioggetto con ~ 1 ml di soluzione di destrano. Chiudere la finestra di freezer e lasciare in un luogo tranquillo per 24-36 ore.
- Mentre cogliere il coprioggetto con una pinza di plastica, versare l'eccesso destrano e sostituirli nel rack ceramica. Risciacquare più volte il coprioggetto diverse in acqua, e lasciare i coprioggetti in ammollo in acqua per 48 ore. Il vaso può essere agitato delicatamente su un tavolo dei rotatori.
- Asciugare il coprioggetto in forno a 80 gradi Celsius e conservare in un essiccatore a vuoto.
Preparazione liposomi
Doppi strati lipidici supportati sono formate da adsorbente liposomi per un coprioggetto destrano funzionalizzato. Il fusibile adsorbito liposomi con vicenda fino a rottura della membrana piatta e si diffonde sulla superficie.
- Una formulazione tipica liposomi utilizzati nel test è composto da 1,2, dioleoyl-sn-glicero-3-phosphocholine (DOPC), 1-oleoyl-2-palmitoil-sn-glicero-3-phosphocholine (POPC), colesterolo, cervello bovino Disialoganglioside (GD 1a), e N-((6 - (biotinoyl) ammino) Hexanoyl) -1,2-dihexadecanoyl-sn-glicero-3-phosphoethanolamine in un rapporto di 4:4:2:0.1:5 x10 -5. Tutti i componenti sono memorizzati in cloroformio o cloroformio e soluzioni di metanolo.
- Preparare una miscela contenente due micromoli di lipidi con il trasferimento di volumi di ogni componente in una provetta di vetro. Far evaporare il solvente sotto un flusso di gas argon o azoto. Togliere il solvente rimanente lasciando la provetta in un essiccatore a vuoto per due ore.
- Risospendere il film secca lipidica in 400 microlitri di buffer di HNE (5 HEPES mM, 145 mM NaCl, 0,1 mM EDTA).
- Trasferire la sospensione in una provetta di plastica. Congelare la sospensione in un bagno di azoto liquido e scongelare in un bagno di acqua calda. Ripetere questa operazione al gelo / disgelo quattro volte.
- Assemblare un estrusore lipidico 100 nm con una membrana in policarbonato, e estrudere la sospensione lipidica 25 volte. La sospensione deve apparire più trasparente dopo l'estrusione.
- Liposomi dovrebbe essere utilizzato il giorno di preparazione. Possono essere conservati a temperatura ambiente fino al momento dell'uso.
Microfluidic flusso preparazione cellulare
Una cellula semplice flusso microfluidica è costituito da sandwich nastro doppio bastone tra una diapositiva quarzo e un copri funzionalizzato.
- Ottenere un 20x20x3 scivolo quarzo mm. Utilizzare una fresa diamantata a praticare due fori di 1 mm su lati opposti.
- Tagliare un quadrato di 20 mm da uno strato di nastro doppio bastone, e con una lama di rasoio, tagliare una sezione di 2 x 15 mm dal centro.
- Staccare un lato del supporto a nastro, e di aderire il nastro al quarto di gallone britannicoz diapositive. Rispettare l'altro lato per un copri funzionalizzate.
- Tagliate due lunghezze di 20 cm di tubo di polietilene e inserirli nei fori nella diapositiva quarzo.
- Sigillare la cella di flusso con la colla epossidica 5 minuti.
- Quando la colla è indurita, adescare la cella di flusso e il tubo con tampone.
- Un doppio strato lipidico supportati possono essere formate in questa fase di disegno circa 80 microlitri della sospensione liposomi nei canali.
Virus particelle etichettatura
- H3N2 influenza A (X-31) è in genere utilizzato per l'analisi di fusione, ma altri ceppi influenzali e altri virus sono stati utilizzati con successo.
- Virus è etichettato con un massimo di due diversi coloranti fluorescenti per consentire il rilevamento di hemifusion e poro-formazione.
- Sciogliere solforodamina b (SRB) in tampone HNE per ottenere una soluzione 20 mM. Combina 20 microlitri della soluzione colorante con 10 microlitri della sospensione virale, e lasciare a temperatura ambiente per 20 ore. Durante questo periodo, colorante lentamente si accumulano all'interno le particelle del virus.
- Rimuovere il colorante in eccesso passando il virus attraverso la sospensione di una colonna PD-10 dissalazione. Se un numero sufficiente di materiale virale viene utilizzata, una banda colorata si può vedere nella colonna. Questa band contiene virus etichettati e possono essere raccolte in quanto è eluiti.
- Se nessuna banda è visibile, raccogliere 200 microlitri frazioni e determinare quali frazioni contenenti virus etichettati misurando l'assorbimento 565 nm in uno spettrofotometro. Il virus dovrebbe eluire in un volume totale di circa 0,8 ml.
- Etichetta l'involucro virale con l'aggiunta di 13 microlitri di una formammide 2 mM dimetil (DMF), soluzione di ottadecile rodamina 110 (Rh110C18) per l'etichetta sospensione virus SRB.
- Mescolare la sospensione collegando il tubo di un rotatore di laboratorio e lasciare per 3 ore.
- Purificare il virus da eccesso Rh110C18 con un PD-10 colonna dissalazione come descritto in precedenza.
Microscopio configurazione
L'esperimento è eseguito su un microscopio a fluorescenza dotato di un obiettivo ad immersione olio NA adatto per un totale di microscopia a fluorescenza di riflessione interna. Le linee 488 e 568 nm da un argon / krypton gas laser sono utilizzati per eccitare il virus Rh110C18 e SRB etichettati. Elaborazione simultanea delle immagini di ogni etichetta si ottiene dividendo l'emissione di fluorescenza verde e rosso con uno specchio dicroico e di messa a fuoco le immagini in modo indipendente su due metà separate di un elettrone telecamera CCD moltiplicando.
Esecuzione del saggio
L'esecuzione del test fusione comporta una assemblea graduale dei componenti biochimici all'interno della cella di flusso: montaggio del doppio strato lipidico planare, attracco di particelle virali etichettati, rivestimento della superficie con fluoresceina, e l'avvio della reazione con tampone pH basso (Figura 1A) .
- Montare il flusso di cellule sul palco microscopio, e collegare il tubo di uscita ad una pompa siringa impostata portata ad una velocità di 40 microlitri al minuto.
- Cancella i canali di flusso dei liposomi in eccesso che scorre in 300 microlitri di HNE.
- Messa a fuoco il microscopio e regolare la potenza del laser per illuminare la superficie con 350 W / cm 2 di 488 nm e luce 70 W / cm 2 di 568 nm di luce. Se si utilizza un obiettivo 60x NA 1,45 immersione in olio, impostare le intensità laser a 100 Watt e 20 Watt micro micro, rispettivamente.
- Pompa virus etichettati (diluito 1 / 100) in una cella di flusso. Poiché il virus si diffonde sulla superficie inferiore del canale di flusso, le particelle cominceranno a aderire alla gangliosidi incorporati nel doppio strato lipidico.
- Quando una densità adeguata di particelle virali ancorata è stato raggiunto (fino a circa 1000 particelle per campo visivo). Accendere il tubo di aspirazione ad una soluzione contenente due microgrammi per millilitro streptavidina marcate con fluoresceina. La streptavidina etichettati legherà alla biotina molecole di lipidi nel doppio strato accoppiato, e alla fine uno sfondo verde debole sarà visibile.
- Lavare il canale di flusso con 300 microlitri di HNE.
- Scegliere un'area di imaging, messa a fuoco del microscopio e preparare la camera CCD per tempo trascorso acquisizione di immagini. Impostare il tempo di esposizione di 100 ms e raccogliere i fotogrammi a una velocità di 10 Hz.
- Avviare fusione per scorrere in un buffer acido contenente 10 mM citrato di sodio e 140 mM NaCl. Il pH del tampone deve essere regolato al di sotto del pH critico del virus viene testato. X-31 fusibili a pH al di sotto di 5.5.
Rappresentante Risultati
Figura 1B mostra le istantanee del doppio strato virioni ancorata prima e durante la fusione. Ogni spot diffrazione limitata rappresenta una singola particella di virus. Fluorescenza rossa e verde sono stati separatamente sul fotografato la metà superiore e inferiore di una camera CCD, permettendo l'osservazione simultanea della busta virale e le etichette dei contenuti. Ci sono in genere luoghi doppio nel canale verde rispetto alil rosso, e questo riflette la minore efficienza di etichettatura da parte del colorante contenuto rispetto all'etichetta busta. La fluorescenza di fondo verde emessa dalla superficie legato fluoresceina scompare all'arrivo del buffer citrato e permette di determinare l'orario di inizio della reazione di fusione. Hemifusion eventi vengono rilevati come esplosioni di fluorescenza verde come il Rh110C18 spento nel diffonde virale attraverso il gambo hemifusion ed è diluito nella membrana planare. Una nuvola di espansione verso l'esterno fluorescenti può essere visto in giro particelle hemifused, dimostrando la libera diffusione dei grassi-acil colorante legato nella membrana planare. Formazione di pori si osserva come il decadimento della fluorescenza rossa da SRB intrappolati dentro l'interno delle particelle virali. L'apertura di un poro di fusione permette la tintura di fuggire nello spazio acqueo sottostante il doppio strato planare e fuori della regione di osservazione.
Traiettorie intensità di fluorescenza per ogni particella, tracciati dalla intensità integrata delle singole particelle, di facilitare la determinazione del rendimento e dei tempi di hemifusion e formazione di pori (Fig. 1C). Orari degli eventi Hemifusion e la formazione dei pori sono determinati come il punto in cui la pendenza massima di una raffica Rh110C18 fluorescenza o di decadimento del segnale SRB si verifica. In un esperimento di successo, circa il 50 per cento delle particelle etichettate con segnali di resa Rh110C18 dequenching, e il 30 per cento delle particelle SRB etichettato dare segnale utilizzabile. Delle particelle etichettate con entrambe le tinture, circa il 10 per cento mostrano sia la miscelazione e la formazione dei pori segnali lipidici.
Fig. 2A-C mostra la distribuzione dei pori hemifusion e tempi di latenza formazione di un tipico esperimento. Fig.2D-F mostra distribuzioni caso di eventi combinati da cinque esperimenti effettuati nelle stesse condizioni. Anche con un modesto numero di osservazioni, la forma degli istogrammi è evidente. Poiché ogni esperimento è sincronizzato con il rilevamento del tempo caduta del pH, gli esperimenti multipli possono essere combinati e informazioni dettagliate sulla limitazione della velocità passi intermedi possono essere ottenuti.
Figura 1. Disegno sperimentale. A) Le particelle virali vengono etichettati con due coloranti fluorescenti per il monitoraggio della cinetica di hemifusion e la formazione dei pori di fusione. Fluorescenza viene raccolto da un alto-NA obiettivo microscopio e ripreso su un CCD. B) le immagini a fluorescenza prima (a sinistra) e durante (a destra) la fusione delle singole particelle virali. Metà superiore e inferiore di ogni immagine corrisponde alla fluorescenza rossa e verde, rispettivamente, della stessa area ~ 50 x 100 mm 2 del doppio strato supportati. C) L'intensità della fluorescenza del tracciante contenuto SRB rosso virale (traccia superiore), il verde Rh110C18 membrana colorante (al centro tracce), e il sensore del pH fluoresceina (traccia inferiore) forniscono orari esatti trascorsi tra calo del pH, hemifusion, e la fusione. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 1.
Figura 2. Cinetica fusione del virus fluorescente. Distribuzioni del tempo trascorso tra la caduta del pH e hemifusion (A, D) e formazione di pori (B, E). L'ascesa e la decadenza delle distribuzioni indicano la presenza di molteplici passaggi intermedi. La transizione tra hemifusion e l'apertura di un poro di fusione per singole particelle è distribuito esponenzialmente, suggerendo un unico fattore limitante. Pannelli AC mostrano i risultati di un singolo esperimento. DF pannelli sono compilati da cinque esperimenti separati eseguiti alle stesse condizioni. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 2.
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Discussion
Preparazione di liquido e continuo doppi strati lipidici supportati può essere impegnativo. Tracce di contaminanti difetti di materiale o superficie impediscono la diffusione di doppi strati. Pulizia accurata e la deposizione di uno strato uniforme di destrano sono essenziali.
L'imaging prolungata di particelle di virus può candeggina le etichette fluorescenti o farli diventare inattivato. Foto-danni di questo tipo è ben noto nella bio-imaging e campi di singola molecola ed è generalmente crede che derivano dalla generazione di specie reattive dell'ossigeno dal fluorofori eccitati. Per ridurre al minimo i danni foto-, in genere minimizzare la potenza del laser di eccitazione e di evitare l'esposizione prolungata prima di iniziare l'esperimento. Impoverimento di ossigeno dai buffer con uno dei sistemi di ossigeno diversi scavenging riportato può essere utile.
La possibilità di ottenere informazioni su transitori stati intermedi richiede che la reazione di fusione con precisione sincronizzato. La portata utilizzata e il volume morto del tubo di aspirazione e delle cellule dei canali di flusso sono fattori che possono limitare la sincronizzazione. Fusion è avviata da neutrale per lo scambio di tampone pH acido. Tuttavia, come il buffer acido viaggia attraverso il tubo di ingresso nella cella di flusso, l'interfaccia tra i due buffer mescola attraverso la diffusione e diventa sempre meno ben definiti. Il gradiente di pH conseguente doppio strato in superficie tende a sfocare la determinazione del tempo di avvio. Inoltre, poiché la fusione cinetica dipende dalla concentrazione di protoni, un gradiente di pH all'inizio dell'esperimento potrebbe complicare l'interpretazione dei risultati. Nell'esperimento mostrato qui, la cinetica di fusione è molto più lento il tempo di transizione del pH, e l'effetto gradiente non influisce significativamente sulla cinetica di fusione. Stiamo attualmente lavorando su modifiche alle nostre cellule di flusso che ci avrebbe permesso di riempire il tubo di aspirazione con il buffer desiderato prima di deviare il flusso nella cella di flusso.
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Acknowledgments
Il lavoro è stato sostenuto da NIH concede AI57159 (a SCH) e AI72346 (a AMvO). SCH è un Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning cover glass squares, 25 mm | Sigma-Aldrich | CLS286525 | |
| Fused silica slides | Technical Glass | ||
| Staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| (3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane | Gelest Inc. | SIG5840.1 | |
| Dextran T-500 | Pharmacosmos | 5510 0500 4006 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850375 | |
| 1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850457 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipid, Inc | 700000 | |
| N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE) | Invitrogen | B1616 | |
| Streptavidin, fluorescein conjugate | Invitrogen | S-869 | |
| Disialoganglioside GD1a from bovine brain | Sigma-Aldrich | G2392 | |
| Mini Extruder | Avanti Polar Lipid, Inc | 610000 | |
| 0.1 micron polycarbonate membrane filters | Whatman, GE Healthcare | 800309 | |
| 10 mm drain discs (membrane supports) | Whatman, GE Healthcare | 230300 | |
| Sulforhodamine b sodium salt | S1402 | ||
| Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18) | See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol | ||
| PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Nikon fluorescence microscope | Nikon Instruments | TE2000-U | |
| Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective | Nikon Instruments | ||
| Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser | Coherent Inc. | ||
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702213 |
References
- Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers. Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).
- Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).
