Summary
هذا البروتوكول يوضح كيفية الجهد الحساسة الأصباغ البصرية للتمكن من تسجيل النشاط الكهربائي من الشبكات العصبية سليمة مثل الضفائر للنظام العصبي الخنازير الغينية المعوية ، مع قرار تعديل والتي تتراوح من واحد الى خلايا متعددة الدوائر العقدية.
Abstract
النظام العصبي المعوي (ENS) هو عبارة عن شبكة قائمة بذاتها مع المهام المحددة ، وقادرة على أداء السلوك المعقد في عزلة. يتم ترتيب الخلايا العصبية والخمسين (10-25 ميكرون في القطر) في الضفائر التي تقتصر على طائرات متميزة من جدار المعي
Protocol
الجزء 1 : إعداد الأنسجة
- يتم عزل تحت المخاطية العضلية المعوية والاستعدادات التي تشريح الضفيرة متسلسلة من الامعاء الصغيرة من 200G - 150 (2-3 أسبوع من العمر) هارتلي الخنازير الغينية التي تم تخدير عن طريق الاستنشاق وisoflurane مقطوعة الرأس. بعد القتل الرحيم ، ورفعه الأمعاء الدقيقة ومحتوياته تحذف من قبل بيغ التجويف بمحلول دافئ الاوكسيجين. نستخدم متوسطة 199 تستكمل مع HEPES 25 ملم ، 5 ملم NaHCO 3 و 2 الجلوتامين ملم ، ودرجة الحموضة تعديلها إلى 7.4 (المشار إليها ، من الآن فصاعدا ، كما DM - M199) ، الذي تم مسبقا في درجة حرارة 37 درجة مئوية. جميع الخطوات المتبقية من البروتوكول ، ومع ذلك ، سيتم تنفيذها في درجة حرارة الغرفة.
- يتم نقل قطعة المعوية ، 8-10 سم في الطول ، لطبق يحتوي Sylgard M199 - DM ، فتحت على طول الحدود المساريقي ، وشنت الغشاء المخاطي الجانب المتابعة باستخدام دبابيس الحشرات. فمن المهم للغاية الحفاظ على التوتر حتى ، بحيث تعلق بعد النسيج المعارض شكل مستطيل مع صفوف من الزوائد المخاطية الانحياز بانتظام.
- باستخدام الملقط غرامة دومون مع نصائح مباشرة ، في وضع أفقي تقريبا ، فمن السهل أن قشر الغشاء المخاطي عن طريق الاستيلاء على الزوائد في نهاية واحدة لإعداد وتبتعد على طول المحور الطولي للنسيج. عندما يعلق العينة بالتساوي ، يمكن فصل شرائط من الغشاء المخاطي في السكتات الدماغية فرد قليلة ، كشف مخاطية العقد الذي يحتوي على الأوعية الدموية تحت المخاطية وتحت المخاطية.
- تشريح للغرامة من الضفائر ، ونحن نوصي باستخدام مجهر تشريح داكنة مع حقل الإضاءة. في الواقع ، والزائفة ثلاثي الأبعاد تأثير الناجم عن هذا النوع من الإضاءة يساعد على التمييز بين الطبقات الفردية ، وبالتالي منع أو الحد من الأضرار التي ألحقتها الصك.
- التحضير لإجراء تحت المخاطية ، ونحن نتابع هذا الإجراء الكلاسيكية هيرست وMcKirdy 4 يتطلب : أ) إجراء خفض في الطبقة تحت المخاطية في أعقاب اتجاه الألياف العضلية الدائرية ، ويمكن تحقيق ذلك باستخدام مقص جيد جدا (مثل موريا MC19 أو ما يعادلها) ؛ ب) رفع مخاطية بلطف شديد مع ملقط غرامة ، في حين دفع طبقة العضلات الدائرية أسفل باستخدام مقص غرامة ج) قطع طولية على طول الحواف كما فصل يتقدم لتحرير مخاطية من بقية الإعدادية ؛ د) إجراء خفض الثانية بعد اتجاه الألياف العضلية الدائرية على مسافة واحدة من الأولى ، لتحديد الحجم النهائي للتحضير تحت المخاطية. ويمكن تحويل الجزء الناتجة تحت المخاطية ، والتي ليست سوى 3-50 ميكرون سميكة ، ولها مظهر لعاب الشمس ، وطبق آخر Sylgard الطازجة التي تحتوي على M199 - DM ، دبس بلطف وبدون توتر ، وأبقى في غرفة الاوكسيجين لاستخدامها لاحقا.
- الأصلي الأمعاء ، الجزء ، وحرم الآن من الغشاء المخاطي وتحت المخاطية ، ومع العضلات الدائرية المكشوفة ، لا يزال من الممكن استخدامها لانتاج مستحضر الضفيرة العضلية المعوية. لفضح الضفيرة العضلية المعوية ، لا بد من القضاء على أكبر قدر ممكن من طبقة العضلات الدائرية. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام نفس القسط غيض ملقط غرامة العاملين في الخطوات السابقة. يمكن سحب حزم من الألياف بعيدا برفق ، أولا من واحد ، ثم من الجانب الآخر من التحضير. لا يمكن أن يتعرض الضفيرة العضلية المعوية يمكن فصلها عن طبقة من العضلات الطولية والمصلية الأساسية. بالتالي ، ما يسمى الضفيرة العضلية المعوية إعداد هو الجزء الذي يمكن أن تقطع على طول المسامير. لأنه يحتوي على العضلات الحية ، فإنه من المستحسن أن دبوس أنه فضفاض للغاية في صحن يحتوي على الاوكسيجين M199 - DM حتى تبدأ التجربة الفسيولوجية.
- منذ الغشاء المخاطي هو استشعار ENS الرئيسي ، وتعتبر جزءا لا يتجزأ أيضا جميع المستجيبات في جدار الأمعاء ، فمن الممكن أن يشرح شبه سليمة تحافظ على الاستعدادات مسارات منعكس بأكمله. هذه الاستعدادات مصمم خصيصا تتطلب مجموعات من الخطوات المذكورة في 1.3. إلى 1.6. ، ينطبق على المناطق المتاخمة للقطعة المعوية المعزولة.
- هي التي شنت بعد دقائق قليلة قبل أن التجربة البصرية الفعلية ، وإعداد خيار في هذه الغرفة التجريبية ، والتأكد من أن يتم توزيعها بالتساوي على التوتر والنسيج يكمن مسطحة تماما ضد Sylgard القاع. ويتحقق هذا من خلال عقد العينة مع عدة دبابيس دقيق جدا يمكن وضعه في جميع أنحاء المحيط دون إلحاق الضرر الأنسجة.
الجزء 2 : تحضير عينات الأنسجة لتسجيل البصرية
- (اختياري) لمنع مضان الخلفية من صبغة ملزمة العضلات الملساء المتبقية والنسيج الضام ، قد حضنت كل من الضفائر معزولة عن 30-60 دقيقة في DM - M199 تحتوي كولاجيناز السابع (≤ 50 يو / مل) ، والبروتياز التاسع (≤ 0.5 ميكروغرام / مل). وينبغي بعد العلاج الانزيم يمكن غسلها مع الاستعدادات ، وبين عشية وضحاها في المحافظة ، DM - M199 زائد 10 ٪ المصل الحيوانية (مثل الخيول أو الأبقار) والمضادات الحيوية (البنسلين ، 100U/ml ؛ الستربتوميسين ، 100 ميكروغرام / مل) ، في الغرفة المشبعة وايال 95 ٪ O 2 و 5 ٪ CO 2. قد يكون هذا الإجراء ، الذي كنا قد استخدمت لسنوات عديدة لأنه يعزز بشكل ملحوظ في نسبة الإشارة إلى الضوضاء من التسجيلات البصرية ، لن تكون مفيدة للمبتدئين وينبغي اعتماد بحذر. في الواقع ، إعداد تضررت خلال تشريح ينطوي على خطر التفكك خلال العلاج الانزيم. ومع ذلك ، حتى في غياب العلاج الانزيم ، ونحن نوصي بأن يتم الحفاظ على الاستعدادات ليلة امس فى DM - M199 مع المصل والمضادات الحيوية. هذه الخطوة تعزز التئام الأنسجة بعد تشريح الضرر الحاد ، ويزيد من الشفافية في العينة.
- لا يمكن التسجيلات البصرية من النشاط الكهربائي يمكن تحقيقه في إعداد فيها العضلات والمقاولات. لذلك ، لمنع تقلص العضلات عند تسجيل من الضفيرة العضلية المعوية ، بضع دقائق قبل أن التجربة البصرية نضيف 2 ميكرومتر النيفيديبين على الاستحمام M199 - DM الأنسجة.
الجزء 3 : يلطخ مع ثنائي ANEPPDHQ - 4
- دي - 4 - ANEPPDHQ متاحة تجاريا في شكل مجفف بالتجميد. نوصي حلها في الإيثانول النقي ، مما يجعل التوصل إلى حل الأسهم تتركز [مل على سبيل المثال ، 15-20 مغ /]. هذا المخزون ، عندما يحتفظ بها في -20 درجة مئوية ، غير مستقر للغاية. في الواقع ، في المختبر لدينا ، ونحن انتهينا للتو من آخر قطرة من محلول المخزون من هذه الصبغة التي كان علينا بذل ما يقرب من 6 سنوات.
- وينبغي إعداد الحل في تلطيخ DM - M199 ، ويجب أن يحتوي على 2 ميكرومتر النيفيديبين إذا كان البروتوكول يتطلب ذلك. ويمكن تركيز الصبغة النهائية لتكون منخفضة مثل 5 ميكروغرام / مل ، وينبغي ألا تكون أعلى من 50 ميكروغرام / مل. ومع ذلك ، تبعا للتركيز على الأسهم ، فإن كمية معينة من الإيثانول تكون موجودة في حل تلطيخ ويجب أن تؤخذ بعين الاعتبار. على سبيل المثال ، حل تلطيخ مع 50 ميكروغرام / مل من صبغة سيحتوي ~ الإيثانول بنسبة 0.3 ٪ إذا مصنوعة من الأسهم ملغ / 15 مل ، ولكن على مقربة من الايثانول 1 ٪ إذا كان السهم قد بتركيز 5 ملغ فقط / مل.
- لتلوين ، الغارقة في التحضير لل10-30 دقيقة في محلول الصبغة. الاوكسيجين بعد تلك الفترة ، يتم غسل الصبغة بعيدا والاستعاضة عنها الطازجة ، M199 - DM. منذ دي - 4 - ANEPPDHQ هو صبغة الأغشية impermeant تتفلور عندما فقط في بيئة الدهون ، يجب أن الخلايا العصبية السليمة من مستحضر المعوية الملون لها مظهر من البالونات الفارغة.
الجزء 4 : التحفيز الكهربائي
- يمكن أن يكون الدافع وراء التحفيز عن طريق الجهد أو الحالية. نستخدم التحفيز الحالية ، التي ينجزها الكمبيوتر التي تسيطر عليها ، والمولدات التحفيز 4 قنوات مع الطاقة الانتاجية القصوى من 16 مللي أمبير لكل قناة.
- يتم تحديد نموذج كهربائي لاستخدامه في التجربة التي قدمها الهدف التجريبية. ويمكن استخدام الخلايا الماصة أو أقطاب التصحيح عندما يكون الهدف هو تحفيز الخلايا العصبيه معينة. عندما يكون القصد من التحفيز لتنشيط أكثر من الخلايا العصبية في عقدة معينة ، قد يتم استخدام إلكترود خارج الخلية لمس الضام. دراسة لربط العقد ، كبيرة كهربائية منخفضة المقاومة و / أو متعددة العناصر ويمكن استخدام المصفوفات الكهربائي ، ولكن عند استخدام التحفيز الحالية كما نفعل عادة ، متعددة العناصر صفائف يصبح الخيار الوحيد. نماذج كثيرة من الأقطاب الكهربائية خارج الخلية ، وكذلك بعض صفائف الكهربائي الخطي ، متاحة بسهولة من المصادر التجارية.
- يمكن وضع أقطاب كهربائية باستخدام أنواع مختلفة من micromanipulators. لتجنب الاهتزاز الناجم عن برميل طويلة وغرامة ، ونحبذ استخدام micromanipulators الصغيرة على أسس المغناطيسية التي يمكن وضعه بالقرب من الغرفة التجريبية ، ودعم مرونة برميل من الأقطاب الكهربائية التنغستن بقضبان معدنية رقيقة ولكن جامدة جدا.
الجزء 5 : الإرواء
نحن نستخدم مضخة تمعجية 2 - القناة مع قناة واحدة لإدخال حلول الاوكسيجين ، والأخرى للإخراج. للقضاء على الاضطرابات الناجمة عن ميكانيكية التروية ، ومضخة تشغيل حالا خلال الحصول على البيانات البصرية.
الجزء 6 : جهاز لتسجيل موقع متعددة البصرية المحتملة الغشاء
- المكونات البصرية :
جهاز لتسجيل موقع متعددة البصرية المحتملة غشاء تضم كاميرا NeuroCCD - SM (RedShirtImaging) و01:10 demagnifier / تتابع العدسة التي شنت على لأنبوب trinocular المجهر تستقيم. المجهر التحركات على مترجم XY ، بصرف النظر عن مرحلة التي يتم إصلاحها بشكل صارم إلى قمة جدول الاهتزاز العزلة النشطة. لتقليل الاهتزاز المحمولة جوا ، ويحيط جهاز كامل من قبل الستائر الثقيلة الصوتية وسقف مايلر. يتم توفير برنامج الموسع للتمنيع ، الإضاءة بواسطة مصباح التنجستن الهالوجين - 100W مدعوم بواسطة مصدر ردود الفعل المتطرفة منخفضة الطاقة تموج استقرت. يتم على ضوء الحادث شبه أحادية اللون باستخدام فلتر الحرارة ، عالية س التدخل تصفية (HQ530/50) ونانومتر 565 (50 ٪ انتقال) مزدوج اللون المرآة. يتم فصل مضان الانبعاثات باستخدام مرآة مزدوج اللون وتصفية طويلة تمرير (HQ572LP). وintenويتم تعديل sity للضوء الحادث باستخدام مرشحات الكثافة محايدة. عبر الإضاءة ، ومشرق الميدان لمشاهدة من إعداد توفرها الثانية 100 مصباح التنجستن الهالوجين W - يقودها الخامس 0-55 ، 1-10 ألف امدادات الطاقة التي لا يشترط لامتلاك أية سمات خاصة. - مواصفات كاميرا عالية السرعة :
وقد وصفت والتصميم الإلكتروني وخصائص أداء الكاميرا NeuroCCD SM - 3 بالتفصيل. لفترة وجيزة ، وهو المبردة ، دقة منخفضة ، والدقة العالية السرعة التي تستخدم الكاميرا الخلفية ضعيفة ، الخلفية مضاءة ماركوني CCD39 - 01 رقاقة (80x80 بيكسل). رقمنة هو 14 بت ، ومعدل الإطار الكامل هو 2 كيلو هرتز. ومع ذلك ، لأغراض محددة ، يمكن للمرء أن زيادة معدل الإطار بحد أقصى 10 كيلو هرتز باستخدام تركيبات مختلفة binning أو تقليل عدد البكسل وظيفية. الكاميرا لديه ميزة هامة للغاية منخفضة الضوضاء قراءة (23 كيلو هرتز الإلكترونات في 2 و 9 من الإلكترونات في 1 كيلو هرتز). بالإضافة إلى ذلك ، بكسل لديها عمق كبير نسبيا أيضا (215000 الالكترونات) ، والسماح شدة الضوء المعتدل في إطار معدلات عالية. - الحصول على البيانات وبرامج التحليل :
ويسيطر على التجربة البصرية التي Neuroplex ، مجموعة من البرامج من RedShirtImaging ، الذي يعمل كتطبيق داخل منصة IDL (التفاعلية البيانات اللغة) ، ويتضمن العديد من الميزات الضرورية للعرض ، واقتناء وتحليل البيانات البصرية. - كاميرا إضافية :
باعتبارها جزءا لا يتجزأ من الجهاز ، وهو التقسيم شعاع على رأسه trinocular من التبديلات مجهر صورة للإعداد على الثانية ، وكاميرا CCD عالية الدقة متصلة المختطف الإطار. ويمكن فرضه على الصورة ، والتي تكتسب وتخزينها باستخدام صورة مختبر العالمية / 2 البرمجيات ، وعلى الشاشة من دون ميلي ثانية واحدة لمرة وحلها الإشارات الضوئية الملتقطة بواسطة الكاميرا NeuroCCD - SM لإنشاء خريطة دقيقة من أصل المكاني لل سجلت بصريا إشارات الجهد. في المختبر ، والمختطف الإطار لهذه الكاميرا موجودة في كمبيوتر مختلف من واحدة مسؤولة عن الحصول على البيانات الفنية. لذلك ، ملف الصورة ونقلها من جهاز كمبيوتر واحد إلى آخر ، ويطلب تعديلات صغيرة في الحجم والموقف من صورة ذات دقة عالية قبل أن يتحقق الكمال من تسجيل اثنين من كاميرات.
الجزء 7 : التجارب البصرية
- قبل كل تسجيل وظيفية ، ونحن الحصول على صورة عالية الدقة بالأسود والأبيض من المنطقة التي نخطط لتسجيل النشاط الكهربائي بالوسائل الضوئية (كما هو مبين في 6.4). هذه الصورة ، عندما فرضه على الخريطة بكسل للكاميرا عالية السرعة ، ويساعدنا على تحديد الهياكل التي هي مصدر الاشارات الضوئية.
- في تكوين نظام مناسب ، Neuroplex (انظر 6.3) يتحكم أيضا في مصراع الكاميرا ، ومشغلات التحفيز الكهربائي. منذ الحصول على بيانات عالية السرعة يتطلب قوة كبيرة في الكمبيوتر ، فمن المستحسن ، إذا كان ذلك ممكنا ، لاستخدام جهاز كمبيوتر مخصص مع كمية كبيرة من الذاكرة والأقراص الصلبة عالية السعة. هذا ، ومع ذلك ، ليس تافها. نظامنا ، على سبيل المثال ، وبالفعل منذ عدة سنوات من العمر ، ويعمل لوحات الحصول على البيانات التي تكون كبيرة جدا لاحتوائه في دولة من بين أحدث أجهزة الكمبيوتر. كحل توفيقي ، الذي اعتمدناه ومكرسة لنظامنا الضوئية بدقة 390 من Dell مزودة محرك الأقراص الصلبة 500 جيجابايت و 4 جيجابايت من ذاكرة الوصول العشوائي. يسمح هذا الكمبيوتر لنا أن نحافظ على كبار السن ، ولكن كافية ، A / D و D / ألواح ألف ، في حين لا يزال توفير طاقة كافية لتشغيل تجاربنا.
- بمجرد اكتساب هو أكثر ، يمكن Neuroplex عرض النتائج في أشكال متعددة متكاملة ، بعضها مفصل أدناه :
- دعا مساحة شاشة العرض يظهر الصفحة صورة الخام إعداد استولت على النحو الذي كاميرا عالية السرعة 80X80 كإطار الفردية. تراكب على هذه الخريطة بكسل للصورة عالية الدقة التي يتم الحصول عليها الكاميرا الثانية (كما هو موضح في 6.4 و 7.1) بتكرير قدرة المشغل ليالي لتحديد مجالات الاهتمام.
- عندما يتم تحديد خلية من هذا العرض الصفحة تحت السيطرة الماوس ، Neuroplex تلقائيا بتحويل نواتجها البصرية الى آثار تبين حجم التغيير البصرية التي سجلتها تلك بكسل بوصفها وظيفة من الزمن. (على سبيل المثال ، والوقت مقابل ΔF / F). يمكن للمشغل أن تقرر ما إذا كانت هذه الآثار يجب أن تعكس إخراج بكسل الفردية ، أو ، بالأحرى ، الإخراج الفضاء المكاني للمتوسط متعددة على منطقة معينة من التحضير.
- ويمكن أيضا أن تكون البيانات المعروضة في شكل السينما.
لضمان أن يتم استخراج الكامل لجميع المعلومات الواردة في التشغيل التجريبي الفردية ، ومع ذلك ، فإننا نؤيد خارج خط تحليل البيانات البصرية. نتائج هذا التحليل ممثل متوفرة.
الجزء 8 : كيفية تحقيق الجودة الفنية في تجربة بصرية
الويقاس نجاح ه التقنية للتجربة البصرية ، في نهاية المطاف ، من إشارة إلى نسبة الضوضاء من التسجيلات. علاوة على ذلك ، جيدة إشارة إلى نسبة الضوضاء لا ينبع من عيد الغطاس ولكن من الرحلة. كما في أداء الأوبرا ، يتم تحديد النتيجة النهائية التي تعدد العوامل التي تتفاعل بالتآزر. وبالتالي ، لتحقيق تجربة بصرية سليمة من الناحية الفنية ، فإنه لا بد من صقل ومستقل وجهاز بصري والمهارات المطلوبة لكل خطوة فردية للبروتوكول. ما يلي هو قائمة من المجالات من المتاعب المحتملة ، وبعض الاقتراحات لتجنب مشاكل لم تكن متوقعة دائما (5) :
- مصادر الضوضاء
الاستقرار الميكانيكية والبصرية حاسمة عند تسجيل النشاط الكهربائي مع الجهد الحساسة للأصباغ ، وذلك لأن التغيير كسور (ΔF / F) تعكس الاستجابات الفسيولوجية هي صغيرة نسبيا (<10 ٪ / 100 بالسيارات في معظم التسجيلات الأمعاء) وتتبع دائما صاخبة بشير نتيجة سيئة. لذلك ، لتحسين الإشارات إلى نسبة الضوضاء ، لا بد من القضاء عليها ، أو ، على الأقل ، للحد ، ومساهمات من المجرمين two أسوأ : أ الاهتزازات) الميكانيكية ، وب) تقلب مصدر الضوء.- الاهتزازات الميكانيكية يتم إنشاؤها من قبل مجموعة متنوعة من مصادر متنوعة مثل تكوين الإعداد ، وبناء الاستقرار ، والقرب من المعدات الميكانيكية ، والهواء ، التيارات ، والضجيج ، حركة السوائل ، أو الجزيئات العائمة في حل الاستحمام. وخير نظام الاهتزاز والعزل ، والستائر الصوتية لحالات متطرفة (انظر ، على سبيل المثال ، وصف في 5.1) ، أن تحدث فرقا كبيرا وتستحق تكلفتها. بالإضافة إلى ذلك ، النهج البديهية ، مثل ترشيح من الحلول التي استخدمت في التجربة ، أو استخدام قواعد المغناطيسي لقطع صغيرة ومتحركة من الإعداد ، لا تكون فعالة جدا.
- مصادر الضوء والأكثر استقرارا في شبه أقصى كثافة. ولذلك ، ينبغي للمرء أن يضع حدا الجاري لإمدادات الطاقة ، وعند الضرورة ، والحد من شدة الضوء عن طريق إدخال محايدة الكثافة المرشحات في مسار الضوء بدلا من تقليل الجهد. مصابيح القوس وصاخبة في جوهرها. التنغستن المصابيح الهالوجين أو الثنائيات الباعثة للضوء هي أكثر استقرارا وينبغي أن تكون الخيار المفضل 6.
- عمر الحيوان
وينبغي أن يتم تشريح باستخدام أمعاء الحيوانات الصغيرة لأنه ، كما في النسيج الضام في الأمعاء خشونة مع التقدم في السن ، يصبح من الصعب فصل طبقات الأنسجة الفردية دون إلحاق ضرر كبير على الخلايا العصبية في الضفائر اثنين ، وارد وصادر الذين قد العمليات عبر حدود طبقة و / أو المشروع لمسافة لا بأس به على طول المحور الطولي للامعاء. هذا الاستشارية ، والتي يمكن تجاهله عند دراسة داخل العقدية الاتصالات ، هو أمر بالغ الأهمية عندما يكون الهدف هو تحليل التجريبية المشتركة بين الدوائر العقدية أو تفعيل مسارات المنعكس. - صبغ تدخيل
من المهم أن يستعمل مثل تركيز منخفض صبغة ممكن ، وضروري للحد من التعرض للضوء. على الرغم من دي - 4 - ANEPPDHQ ثبت أن أقل بكثير من الأصباغ الضوئية الأخرى ، وسوف تحصل المنضوية فيه ، في نهاية المطاف ، والحالة الصحية للإعداد تتدهور. صبغ استيعاب يقلل من نسبة الإشارة إلى الضوضاء عن طريق زيادة هائلة في مضان الخلفية 3. - القطب الصيانة
- يجب غسلها بعناية وأقطاب جيدا بعد كل تجربة. الودائع العضوية في نصائح من الأقطاب الكهربائية التنغستن القطب زيادة المقاومة ومنع التحفيز.
- عزل كهربائي التنغستن المتاحة تجاريا حساس جدا وعرضة للضرر. وهناك تسرب في العزل تحويلة الحالية ، وتعرض للخطر فعالية التحفيز وتعرض للخطر نجاح التجربة.
- نضح الأخطار
أبدا ترك غير المراقب انشاء بينما نضح على. إذا كان في تدفق وتدفق للمضخة تمعجية ليست متوازنة بشكل صحيح ، يجوز لاثنين من الأحداث الكارثية تأخذ مكان :- الفيضانات قد يسبب ضررا لا يمكن تداركه المجهر.
- قد إعداد تجف أثناء التجربة.
- برنامج متاعب
لا بد من تعريف الذات مع البرنامج الذي يتحكم في اقتناء وكذلك التحليل. سريع للبيانات اقتناء و / أو إنشاء ملفات كبيرة جدا تميل الى دفع النظام إلى حافة الانهيار ، وNeuroplex ، والتي لا ترحم تماما ، وسوف تعطل بلا هوادة ما لم تحترم الشروط حدودها. الدقيقة في السجلات ، وغاب بسهولة عندما يقتصر التحليل على مناطق محدودة من الفائدة ، وكثيرا ما تكشف نفسها في الفيلم يعرض للبيانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد كتب هذا البروتوكول مع هدفين في الذهن. أول واحد هو إقناع المحققين أخرى ، وذلك بفضل التقدم التكنولوجي كثير من العقد الماضي ، مسجلا البصرية النشاط الكهربائي باستخدام الأصباغ الحساسة الجهد قد تصبح واحدة من المنهجيات ، وأقوى موثوقة وبأسعار معقولة لدراسة الشبكات العصبية سليمة ، بل ويمكن تنفيذه بسهولة حتى في المختبر وجود الموارد المتواضعة. الهدف الثاني هو تعزيز النظام العصبي المعوي كنموذج تجريبي فريد الذي ربط الأحداث الجزيئية والخلوية مع سلوك الكهربائية من الضفائر العصبية two ومخرجاتها البيولوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نود أن نشكر DA كولتر (ختم) على إتاحة الفرصة لنا لاستخدام له 2 الفوتون المجهر للحصول على صور 2 - الفوتون أظهرت في بداية الفيديو ، وتاكانو حاء لتقاسم معنا خبرته الفنية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M3769 | With Earle’s salts Without L-Glutamine, Phenol Red and Sodium Bicarbonate |
| Sylgard | Dow Corning | 184 silicone elastomer kit | |
| Insect pins used for dissection | F.S.T. | 26001-30 | |
| Dumont forceps | F.S.T. | 11203-23 or 11200-33 | |
| Moria MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | F.S.T. | 15371-92 | |
| Pins to hold the tissue during the experiment | Seirin Corp. | Seirin Spinex | |
| Collagenase VII | Sigma-Aldrich | C0773 | |
| Protease IX | Sigma-Aldrich | P6141 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10439-016 | |
| PenStrep | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| L-Glutamine 100X | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Nifedipine | Sigma-Aldrich | ||
| Di-4-ANEPPDHQ | Molecular Probes, Life Technologies | D36802 | |
| 4-Channel Stimulus Generator | Multi Channel System MCS GmbH | 2000 Series | |
| Peristaltic pump | Rainin | 2-channel Dinamax RP-1 | |
| High-speed camera | RedShirtImaging, LLC | NeuroCCD-SM | |
| 1:10 demagnifier / relay lens | Optem, Qioptiq Inc. | ||
| Upright microscope | Olympus Corporation | BX61TRF | |
| Gibraltar fixed stage with motorized X-Y translator | Gibraltar, Burleigh Instruments, EXFO, Quebec, Canada | PSSG--BX2 | |
| Linear matrix electrodes | FHC, Inc. | Custom made | |
| Active vibration-isolation table | Halcyonics,Inc., Menlo Park, CA | Micro 60 | |
| Ultra-low-ripple feedback stabilized power supply | Kepco, Flushing, NY | ATE 75-15M | |
| Heat filter | Schott AG | KG-1 | |
| High-Q interference filter | Chroma Inc. | HQ530/50 | |
| Dichroic mirror | Chroma Inc. | 565 nm (50% transmission) | |
| Long-pass filter | Chroma Inc. | HQ572LP | |
| Acoustic curtains | Acoustical Surfaces, Inc. | BSC-25 | |
| Neuroplex | RedShirtImaging, LLC | ||
| IDL | ITT Visual Information Solutions | ||
| High-resolution CCD camera, with its own camera controller | Hamamatsu Corp. | ||
| Frame-grabber for high-resolution camera | Data Translation | DT3120K-1 | |
| Imaging software for high-resolution camera | Data Translation | Global Lab Image/2 |
References
- Johnson, L. eonard R. in Physiology of the Gastrointestinal Tract, edited by Leonard R. , Raven Press. New York. 1-1 (1987).
- Obaid, A. L. Spatiotemporal patterns of activity in an intact mammalian network with single-cell resolution: optical studies of nicotinic activity in an enteric plexus. J Neurosci. 19 (8), 3073-3073 (1999).
- Obaid, A. L., Loew, L. M., Wuskell, J. P., Salzberg, B. M. Novel naphthylstyryl-pyridinium potentiometric dyes offer advantages for neural network analysis. J. Neurosci. Methods. 134 (2), 179-179 (2004).
- Hirst, G. D., McKirdy, H. C. Synaptic potentials recorded from neurones of the submucous plexus of guinea-pig small intestine. J Physiol (Lond). 249 (2), 369-369 (1975).
- Salzberg, B. M.
- Salzberg, B. M. An ultra-stable non-coherent light source for optical measurements in neuroscience and cell physiology. Journal of Neuroscience Methods. 141, 165-16 (2005).
- Obaid, A. L., Nelson, M. E., Lindstrom, J., Salzberg, B. M. Optical studies of nicotinic acetylcholine receptor subtypes in the guinea-pig enteric nervous system. J Exp Biol. 208 (Pt 15), 2981-2981 (2005).
- Obaid, A. L., Zou, D. J., Rohr, S., Salzberg, B. M. Optical recording with single cell resolution from a simple mammalian nervous system: Electrical activity in ganglia from the submucous plexus of the guinea-pig ileum. Biol. Bull. 183, 344-344 (1992).
- Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system. Nature. 246 (5434), 508-508 (1973).
