Summary
Detta protokoll illustrerar hur spänningskänsliga färgämnen möjliggöra optisk registrering av elektrisk aktivitet från intakta neurala nätverk som plexuses av marsvin enteriska nervsystemet, med en justerbar upplösning som sträcker sig från enstaka celler till flera ganglieblockerande kretsar.
Abstract
Det enteriska nervsystemet (ENS) är ett fristående nätverk med identifierade funktioner, som kan utföra komplexa beteenden i isolering. Dess nervceller (10 till 25 mikrometer i diameter) är ordnade i plexuses som är begränsade till olika plan i tarmväggen
Protocol
Del 1: Tissue förberedelse
- Den submukös och myenteric plexus förberedelser är isolerade med sekventiella dissektion från de små tarmarna av 150-200g (2-3 veckor gammal) Hartley marsvin som har sövda av isofluran inandning och halshuggen. Efter dödshjälp är tunntarmen censurerade och dess innehåll tas bort genom att spola lumen med en varm, syresatt lösning. Vi använder Medium 199 kompletteras med 25 mm HEPES, 5 mm NaHCO 3 och 2 mm Glutamin, och pH-justeras till 7,4 (det hänvisas till, från och med nu, eftersom M199-DM), som har förvärmas vid 37 ° C. Alla de återstående stegen i protokollet, kommer dock att utföras vid rumstemperatur.
- En tarm-segmentet, 8-10 cm långa, överförs till ett Sylgard maträtt som innehåller M199-DM, öppnade längs mesenteriska gränsen, och monterade slemhinna sida upp med insekter stift. Det är oerhört viktigt att upprätthålla ens spänningar, så att efter sätter vävnaden uppvisar en rektangulär form med rader av slemhinnor tarmludd regelbundet justeras.
- Använda fina Dumont pincett med raka tips, i en nästan horisontellt läge är det lätt att skala slemhinnan genom att ta tag i tarmludd i ena änden av preparatet och dra bort längs den längsgående axeln av vävnaden. När provet är jämnt fästs, kan band av slemhinna separeras i några enstaka drag, utsätta submucosa som innehåller submukös ganglierna och submukosala kärlsystemet.
- För den fina dissekering av plexuses, rekommenderar vi att du använder en dissekera mikroskop med mörkfältsbelysning. I själva verket hjälper pseudo tredimensionell effekt skapas genom denna typ av belysning för att skilja de olika skikten och därmed förhindra eller minimera instrument-tillfogade skador.
- För att göra en submukosala förberedelse, följer vi den klassiska förfarandet för Hirst och McKirdy 4 som kräver: a) göra en sänkning av submukosala lagret efter orientering cirkulära muskelfibrer, vilket kan uppnås med mycket fina sax (till exempel en Moria MC19 eller motsvarande), b) lyfta submucosa mycket försiktigt med den fina pincett, samtidigt som du trycker den cirkulära muskeln lagret ner med fina sax, c) att skära längs den längsgående kanterna separation fortskrider att befria submucosa från resten av prep, d) att göra ett andra klipp efter orientering runda muskelfibrer på avstånd från den första, att definiera den slutliga storleken på submukosala beredning. Den resulterande submukosala segmentet, vilket Endast 30 till 50 ìm tjock och har en skir utseende, kan överföras till en annan Sylgard maträtt med färska M199-DM, nålas skonsamt och utan spänning, och förvaras i en syresatt kammare för senare användning.
- Den ursprungliga gut etapper, berövade nu av slemhinna och submucosa, och med den runda muskeln utsätts för, kan fortfarande användas för att ge en myenteric plexus beredning. Att exponera myenteric plexus, måste man eliminera så mycket som möjligt av den cirkulära muskeln lagret. Detta kan uppnås genom att använda samma raka spets fin pincett som används i föregående steg. Buntar av fibrer kan dras försiktigt bort först från en, och sedan från andra sidan av preparatet. De exponerade myenteric plexus kan inte skiljas från den längsgående skikt av muskler och underliggande slemhinnorna. Därför det som kallas myenteric plexus förberedelser är det segment som kan klippas längs stift. Eftersom det innehåller levande muskler, är det lämpligt att stiftet det mycket löst i skålen med syresatt M199-DM tills fysiologiska experimentet börjar.
- Eftersom slemhinnan är den viktigaste ENS sensorn, och alla effektenheter är också inbäddade i tarmväggen, är det möjligt att dissekera halvt intakt preparat som bevarar hela reflex vägar. Dessa skräddarsydda förberedelser kräver kombinationer av steg som beskrivs i 1.3. till 1,6., tillämpas på angränsande områden i de isolerade intestinala segmentet.
- Några minuter innan den faktiska optiska experiment, beredning av val är monterad i experimentella kammaren och se till att spänningen är jämnt fördelad och vävnaden ligger helt platt mot Sylgard botten. Detta uppnås genom att hålla provet med flera mycket fina nålar som kan placeras runt hela omkretsen utan att vålla någon vävnadsskada.
Del 2: Beredning av vävnadsprover för optisk inspelning
- (Valfritt) För att förhindra bakgrundsfluorescens från färgämnet binda till kvarvarande glatt muskulatur och bindväv, kan båda isolerade plexuses inkuberas i 30-60 min i M199-DM innehåller kollagenas VII (≤ 50 U / ml) och proteas IX (≤ 0,5 mikrogram / ml). Efter enzymet behandling förberedelserna ska tvättas med och underhållas övernattning på, M199-DM plus 10% djur serum (t.ex. hästdjur, nötkreatur) och antibiotika (penicillin, 100U/ml, streptomycin, 100 mikrogram / ml), i en kammare mättade with 95% O 2 och 5% CO 2. Detta förfarande, som vi har använt i många år eftersom det märkbart förbättrar signal-brusförhållandet av den optiska inspelningar, kan inte vara bra för nybörjare och bör antas med försiktighet. I själva verket driver en förberedelse skadats under dissektion risken för sönderfallande under enzymet behandlingen. Men även i avsaknad av enzymet behandling rekommenderar vi att förberedelserna skall bibehållas över natten i M199-DM med serum och antibiotika. Detta steg främjar vävnad läkning efter akut dissektion skador och ökar insynen i provet.
- Optisk inspelningar av elektrisk aktivitet kan inte uppnås i en beredning i vilken muskel är upphandlande. För att förhindra muskelkontraktion vid inspelning från myenteric plexus, några minuter före den optiska experiment vi lägger 2 mikroM nifedipin till M199-DM bad vävnaden.
Del 3: färgning med di-4-ANEPPDHQ
- Di-4-ANEPPDHQ är kommersiellt tillgänglig i frystorkat form. Vi rekommenderar att lösa upp det på ren etanol, vilket gör en koncentrerad stamlösning [t.ex. 15-20 mg / ml]. Detta bestånd vid förvaring vid -20 ° C, är extremt stabil. Ja, i vårt laboratorium, slutade vi bara den sista droppen av en stamlösning av detta färgämne som vi hade gjort nästan 6 år sedan.
- Färglösningen bör förberedas på M199-DM och bör innehålla 2 mikroM nifedipin om protokollet kräver det. Den slutliga koncentrationen av färgämnet kan vara så låg som 5 mikrogram / ml och bör inte vara högre än 50 mikrogram / ml. Men beroende på koncentrationen av lager, kommer en viss mängd etanol finnas i färglösningen och bör beaktas. Till exempel, en färgning lösning med 50 mikrogram / ml färg kommer att innehålla ~ 0,3% etanol om den görs från en 15 mg / ml lager, men nära 1% etanol om beståndet hade en koncentration på endast 5 mg / ml.
- För färgning, är förberedelserna under vatten i 10-30 minuter i färglösningen. Efter denna period är färgen tvättas bort och ersättas med nytt, syrerikt M199-DM. Eftersom di-4-ANEPPDHQ är ett membran-impermeant färgämne som fluorescerar endast när i en lipid miljö bör friska nervceller från ett målat enterisk förberedelse ser ut som tomma ballonger.
Del 4: Elektrisk stimulering
- Stimulering kan drivas av spänning eller ström. Vi använder dagens stimulering, som levereras av en datorstyrd, 4-kanals stimulans generator med en maximal effekt på 16 mA per kanal.
- Elektroden modell som skall användas i ett visst experiment bestäms av experimentella målet. Intracellulär pipetter eller elektroder plåster kan användas när målet är stimulering av en viss neuron. När stimuleringen är att aktivera mer än en neuron i en viss ganglion, kan ett extracellulärt elektrod vidröra en sammanbindande användas. Att studera sammankoppling ganglierna, stora, lågresistenta elektroder och / eller av flera element kan elektrod arrayer användas, men då med aktuella stimulans som vi i allmänhet gör, flera element matriser blir det enda alternativet. Många modeller av extracellulära elektroder, samt några linjära arrayer elektrod, är lätt tillgängliga från kommersiella källor.
- Elektroderna kan placeras med olika typer av micromanipulators. För att undvika vibrationer som orsakas av långa och fina fat, för att vi med hjälp av små micromanipulators på magnetiska underlag som kan placeras i anslutning till den experimentella avdelningen, och stödja flexibla fat av volframelektroder med tunna men mycket styv metallstänger.
Del 5: Perfusion
Vi använder en 2-kanals peristaltiska pump med en kanal för inmatning av syresatt lösningar, och den andra för utgången. För att eliminera mekaniska störningar orsakade av perfusion, pumpen är avstängd under förvärvet av optiska data.
Del 6: Apparat för flera webbplats optisk inspelning av membranpotential
- Optiska komponenter:
Apparaten för flera webbplats optisk inspelning av membran potential består av en NeuroCCD-SM kamera (RedShirtImaging) och 1:10 demagnifier / relä-objektiv monteras på Trinokulärt tub med en upprätt mikroskop. Mikroskopet rör sig på ett XY översättare, oberoende av en scen som stelt fast i toppen av en aktiv vibrationsisolering bord. För att minimera luftburen vibrationer är hela apparaten omges av tunga akustiska gardiner och en mylar tak. Epi-belysning tillhandahålls av en 100W volfram-halogen lampa som drivs av en ultra-low-rippel återkoppling stabiliserad strömförsörjning. Det infallande ljuset är tillverkat nästan monokrom med hjälp av en värme filter, hög-Q störningar filter (HQ530/50) och en 565 nm (50% transmission) dikroiskt spegel. Fluorescens utsläpp separeras med dikroiskt spegel och en lång-pass-filter (HQ572LP). Avsiktenmångfald av det infallande ljuset justeras med neutral densitet filter. Trans-belysning, är för ljusa fält visning av preparatet som en andra 100 W volfram-halogen lampa som drivs av en 0-55 V, 1-10 Ett nätaggregat som inte är skyldig att ha några speciella attribut. - Höghastighetskamera specifikationer:
Den elektroniska design och egenskaper prestanda NeuroCCD-SM kamera har beskrivits i detalj 3. Kortfattat är det en kyld, låg upplösning, precision höghastighetskamera som använder back-tunnat, back-belysta Marconi CCD39-01-chip (80x80 pixlar). Digitalisering är 14-bitars, och hela bildhastighet är 2 kHz. Men för särskilda ändamål, kan en ökning av ramen på upp till högst 10 kHz med hjälp av olika binning kombinationer eller minska antalet funktionella pixlar. Kameran har en viktig fördel med extremt låg läsa brus (23 elektroner vid 2 kHz, 9 elektroner vid 1 kHz). Dessutom är dess pixlar har en relativt stor och djup (215 tusen elektroner), som möjliggör måttlig ljusintensiteter vid hög bildhastighet. - Datainsamling och analys:
Den optiska experiment styrs av Neuroplex, ett programpaket från RedShirtImaging, som fungerar som en ansökan inom IDL-plattformen (Interactive Data Language) och innehåller flera funktioner som krävs för förvärv, visning och analys av optiska data. - Ytterligare kamera:
Som en integrerad del av apparaten, en stråldelare på Trinokulärt huvudet av mikroskop reläer en bild av preparatet på en sekund, högupplöst CCD-kamera kopplad till en ram-grabber. Bilden, som förvärvas och lagras med Global Lab Bild / 2 programvara kan läggas ovanpå på visningen av sub-millisekund tidsupplöst optiska signaler fångas upp av NeuroCCD-SM kamera för att skapa en exakt karta över den rumsliga ursprung optiskt inspelade spänningssignaler. I vårt labb, bosatt ramen grabber för denna kamera i en annan dator än den som ansvarar för funktionell datainsamling. Därför har bildfilen som ska överföras från en dator till en annan och små justeringar i storlek och placeringen av högupplöst bild krävs innan perfekt registreringen av de två kamerorna uppnås.
Del 7: Optisk experiment
- Inför varje funktionell inspelning, förvärvar vi den högupplösta svartvita bilden av regionen där vi planerar att spela in elektriska aktiviteten optiska medel (såsom anges i 6.4). Denna bild, då överlagrade på pixel-map av höghastighetskamera, hjälper oss att identifiera de strukturer som är källan till de optiska signalerna.
- Under lämpliga systemkonfiguration, kontroller Neuroplex (se 6.3) även på avtryckaren, och utlöser elektrisk stimulering. Eftersom hög hastighet datainsamling kräver stor datorkraft, är det lämpligt, om det alls är möjligt att använda en dedikerad dator med en stor mängd minne och en hög kapacitet hårddisk. Det är dock inte trivial. Vårt eget system, t.ex. redan flera år, sysselsätter datainsamling styrelser som är för stora för att passa i state-of-the-art datorer. Som en kompromiss antog vi och engagerar sig för våra optiska systemet en Dell Precision 390 utrustad med en 500 GB hårddisk och 4 GB RAM. Denna dator får oss att hålla våra äldre, men tillräckliga, A / D och D / A-brädor, och samtidigt ge tillräcklig kraft för att driva våra experiment.
- Så snart förvärvet är över, kan Neuroplex visa resultaten i flera kompletterande format, av vilka några beskrivs nedan:
- Ett område på skärmen som kallas sidan visar den grova bilden av beredningen som fångas upp av 80x80 höghastighetskamera som en enskild bildruta. Superposition till denna pixel-karta av högupplöst bild förvärvas med den andra kameran (som förklaras i 6.4 och 7.1) förfinar operatörens förmåga att identifiera områden av intresse.
- När pixlar på denna sida visas väljs ut inom ramen muskontroll konverterar Neuroplex automatiskt deras optiska utgångar till spår som visar storleken på den optiska förändringen registrerats av dessa pixlar som en funktion av tiden. (T.ex. ΔF / F vs tid). Operatören kan avgöra om dessa spår bör återspegla produktionen av enskilda pixlar, eller snarare utrymmet-snitt produktion på flera loci över en viss region av preparatet.
- Uppgifterna kan också visas i film-format.
För att säkerställa att all information i enskilda experimentella körs helt utvinns dock gynnar vi off-line analys av optiska data. Representativa resultat av denna analys är tillgängliga.
Del 8: Hur att uppnå tekniska kvaliteten i ett optiskt experiment
The teknisk framgång för ett optiskt experiment mäts i slutändan av signal-brusförhållandet av inspelningarna. Dessutom härstammar en bra signal-brus-förhållandet inte från en uppenbarelse utan från en resa. Som i en operaföreställning, är det slutliga resultatet bestäms av ett flertal faktorer som samverkar synergistiskt. Således, för att uppnå ett tekniskt sunda optiska experiment, är det viktigt att förfina, självständigt, den optiska apparater och de färdigheter som krävs för varje enskilt steg i protokollet. Här följer en lista över potentiella problem-områden och några förslag för att undvika problem inte alltid förväntad 5:
- Bullerkällor
Mekanisk och optisk stabilitet är avgörande när du spelar in elektriska aktivitet med spänningskänsliga färgämnen, eftersom fraktionerad förändring (ΔF / F), vilket återspeglar fysiologiska reaktioner är relativt liten (<10% / 100 mV i de flesta av tarmen inspelningar) och en bullrig spår alltid bådar ett dåligt resultat. Därför att optimera signal-brus-förhållande är det absolut nödvändigt att eliminera eller åtminstone minimera, bidragen från de två värsta syndarna: a) mekaniska vibrationer, och b) ljuskälla fluktuationer.- Mekaniska vibrationer genereras av en mängd olika källor så olika som konfigurationen, bygga stabilitet, närhet av motoriserade utrustning, luft-strömmar, akustiskt buller, flytande rörelser, eller partiklar i badet lösningen. En bra vibrations-isolering systemet och akustiska gardiner för extrema fall (se t.ex. beskrivning i 5.1), gör en stor skillnad och är väl värda sitt pris. Dessutom sunt förnuft metoder, såsom filtrering av lösningar som används i experimentet, eller användning av magnetiska baser för små, flyttbara delar av installationen är ganska effektiva.
- Ljuskällor är mest stabila på nästan maximal intensitet. Därför bör man sätta en ström-gräns för strömförsörjning, och vid behov, minska ljusstyrkan genom att sätta neutrala densitet filter i ljusstrålen istället för genom att minska spänningen. Båglampor sig är högljudda. Volfram-halogenlampor eller lysdioder är mycket mer stabil och bör vara förstahandsval 6.
- Djurens ålder
Dissektioner bör ske med hjälp av tarmen av unga djur eftersom det, som i bindväven i tarmen toughens med åldern, blir det svårare att separera enskilda vävnaderna utan att vålla stora skador på nervceller i två plexuses, vars afferenta och efferent processer kan kors lager gränser och / eller projekt för ganska avståndet längs den längsgående axeln i tarmen. Denna rådgivande, som kan bortses från när man studerar inom ganglieblockerande anslutningar, är av avgörande betydelse när den experimentella målet är analysen av inter-ganglieblockerande kretsar eller aktivering av reflexen vägar. - Dye internalisering
Det är viktigt att använda så låg ett färgämne koncentration som möjligt och att minimera onödig ljusexponering. Även om di-4-ANEPPDHQ har visat sig vara mycket mindre fototoxiska än andra färger, kommer det att bli internaliserade, så småningom, eftersom hälsan av preparatet försämras. Dye internalisering minskar signal-brus-förhållande genom att öka dramatiskt bakgrundsfluorescens 3. - Elektrod underhåll
- Elektroder ska tvättas noggrant och grundligt efter varje experiment. Organiska avlagringar på tips av volframelektroder öka elektrod motståndet och förhindra stimulering.
- Isoleringen av kommersiellt tillgängliga volfram elektroden är mycket känslig och utsatt för skador. En läcka i isoleringen kommer shunten ström, äventyra effektiviteten av stimulans och äventyra ett framgångsrikt genomförande av försöket.
- Perfusion faror
Lämna aldrig set-up utan uppsikt när perfusionen är på. Om i-flöde och ut-flöde av den peristaltiska pumpen är inte riktigt balanserade, kan två katastrofala händelser äga rum:- En översvämning kan orsaka obotliga skador på mikroskopet.
- Beredningen kan torka ut under experimentet.
- Programvara krångel
Det är viktigt att bekanta sig med den programvara som styr förvärv samt analys. Snabb data-förvärv och / eller skapandet av mycket stora filer tenderar att driva systemet till randen av sammanbrott, och Neuroplex, vilket är ganska oförlåtande, kommer att krascha obevekligt om inte dess randvillkor respekteras. Subtiliteter inom posterna, enkelt missat när analysen är begränsad till begränsade områden av intresse, ofta visar sig i filmen visar av uppgifterna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll har skrivits med två mål i åtanke. Den första är att övertyga andra forskare som, tack vare de många tekniska framsteg det senaste decenniet, optisk inspelning av elektriska aktivitet med hjälp av spänningskänsliga färgämnen har blivit en av de mest kraftfulla, pålitliga och prisvärda metoder för att studera intakta neuronala nätverk, ja kan det vara lätt att genomföra även i ett laboratorium som har små resurser. Det andra målet är att främja det enteriska nervsystemet som en unik experimentell modell där att korrelera molekylära och cellulära händelser med den elektriska beteende av de två neuronala plexuses och deras biologiska utgångar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vill tacka DA Coulter (CHOP) för att tillåta oss att använda sin 2-photon mikroskop för att förvärva 2-fotonen bilder som visas i början av videon, och H. Takano för att dela med oss med sin tekniska expertis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M3769 | With Earle’s salts Without L-Glutamine, Phenol Red and Sodium Bicarbonate |
| Sylgard | Dow Corning | 184 silicone elastomer kit | |
| Insect pins used for dissection | F.S.T. | 26001-30 | |
| Dumont forceps | F.S.T. | 11203-23 or 11200-33 | |
| Moria MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | F.S.T. | 15371-92 | |
| Pins to hold the tissue during the experiment | Seirin Corp. | Seirin Spinex | |
| Collagenase VII | Sigma-Aldrich | C0773 | |
| Protease IX | Sigma-Aldrich | P6141 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10439-016 | |
| PenStrep | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| L-Glutamine 100X | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Nifedipine | Sigma-Aldrich | ||
| Di-4-ANEPPDHQ | Molecular Probes, Life Technologies | D36802 | |
| 4-Channel Stimulus Generator | Multi Channel System MCS GmbH | 2000 Series | |
| Peristaltic pump | Rainin | 2-channel Dinamax RP-1 | |
| High-speed camera | RedShirtImaging, LLC | NeuroCCD-SM | |
| 1:10 demagnifier / relay lens | Optem, Qioptiq Inc. | ||
| Upright microscope | Olympus Corporation | BX61TRF | |
| Gibraltar fixed stage with motorized X-Y translator | Gibraltar, Burleigh Instruments, EXFO, Quebec, Canada | PSSG--BX2 | |
| Linear matrix electrodes | FHC, Inc. | Custom made | |
| Active vibration-isolation table | Halcyonics,Inc., Menlo Park, CA | Micro 60 | |
| Ultra-low-ripple feedback stabilized power supply | Kepco, Flushing, NY | ATE 75-15M | |
| Heat filter | Schott AG | KG-1 | |
| High-Q interference filter | Chroma Inc. | HQ530/50 | |
| Dichroic mirror | Chroma Inc. | 565 nm (50% transmission) | |
| Long-pass filter | Chroma Inc. | HQ572LP | |
| Acoustic curtains | Acoustical Surfaces, Inc. | BSC-25 | |
| Neuroplex | RedShirtImaging, LLC | ||
| IDL | ITT Visual Information Solutions | ||
| High-resolution CCD camera, with its own camera controller | Hamamatsu Corp. | ||
| Frame-grabber for high-resolution camera | Data Translation | DT3120K-1 | |
| Imaging software for high-resolution camera | Data Translation | Global Lab Image/2 |
References
- Johnson, L. eonard R. in Physiology of the Gastrointestinal Tract, edited by Leonard R. , Raven Press. New York. 1-1 (1987).
- Obaid, A. L. Spatiotemporal patterns of activity in an intact mammalian network with single-cell resolution: optical studies of nicotinic activity in an enteric plexus. J Neurosci. 19 (8), 3073-3073 (1999).
- Obaid, A. L., Loew, L. M., Wuskell, J. P., Salzberg, B. M. Novel naphthylstyryl-pyridinium potentiometric dyes offer advantages for neural network analysis. J. Neurosci. Methods. 134 (2), 179-179 (2004).
- Hirst, G. D., McKirdy, H. C. Synaptic potentials recorded from neurones of the submucous plexus of guinea-pig small intestine. J Physiol (Lond). 249 (2), 369-369 (1975).
- Salzberg, B. M.
- Salzberg, B. M. An ultra-stable non-coherent light source for optical measurements in neuroscience and cell physiology. Journal of Neuroscience Methods. 141, 165-16 (2005).
- Obaid, A. L., Nelson, M. E., Lindstrom, J., Salzberg, B. M. Optical studies of nicotinic acetylcholine receptor subtypes in the guinea-pig enteric nervous system. J Exp Biol. 208 (Pt 15), 2981-2981 (2005).
- Obaid, A. L., Zou, D. J., Rohr, S., Salzberg, B. M. Optical recording with single cell resolution from a simple mammalian nervous system: Electrical activity in ganglia from the submucous plexus of the guinea-pig ileum. Biol. Bull. 183, 344-344 (1992).
- Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system. Nature. 246 (5434), 508-508 (1973).
