Summary
इस प्रोटोकॉल illustrates कैसे वोल्टेज के प्रति संवेदनशील रंगों जैसे गिनी सुअर अंत्र तंत्रिका तंत्र के plexuses बरकरार तंत्रिका नेटवर्क से बिजली की गतिविधि के ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग, एक समायोज्य संकल्प के साथ सक्षम है कि एकल कक्षों से बहु - ganglionic circuitry पर्वतमाला.
Abstract
आंतों का तंत्रिका तंत्र (ENS) पहचान कार्यों के साथ एक नेटवर्क आत्म निहित, अलगाव में जटिल व्यवहार के प्रदर्शन में सक्षम है. इसके न्यूरॉन्स (व्यास में 10 से 25 सुक्ष्ममापी) plexuses कि आंत की दीवार के विशिष्ट विमानों तक ही सीमित कर रहे हैं में व्यवस्थित कर रहे हैं
Protocol
भाग 1: ऊतक तैयारी
- submucous और myenteric जाल तैयारी (2-3 सप्ताह पुराने) 150-200g हार्टले गिनी सूअरों है कि isoflurane साँस लेना और decapitated द्वारा anesthetized गया है की छोटी आंतों से अनुक्रमिक विच्छेदन के द्वारा अलग कर रहे हैं. इच्छामृत्यु के बाद, छोटी आंत और excised है और उसकी सामग्री को एक गर्म, oxygenated समाधान के साथ लुमेन निस्तब्धता द्वारा हटाया. हम 199 मध्यम 25 मिमी HEPES, 5 मिमी 3 NaHCO और 2 मिमी Glutamine, और पीएच 7.4 (भेजा, अब से M199-डीएम के रूप में,) करने के लिए समायोजित, ° जो किया गया है 37 में पूर्व गरम सी. के साथ पूरक का उपयोग करें प्रोटोकॉल के सभी शेष चरणों, लेकिन, कमरे के तापमान पर बाहर किया जाएगा.
- एक आंतों खंड, लंबाई में 8-10 सेमी, एक Sylgard पकवान युक्त M199 - डीएम, mesenteric सीमा पर खोला को सौंप दिया है, और mucosa की ओर ऊपर घुड़सवार कीट पिन का उपयोग कर. यह अत्यंत महत्वपूर्ण है भी तनाव को बनाए रखने के लिए, ताकि लगाए बाद ऊतक mucosal villi नियमित रूप से गठबंधन की पंक्तियों के साथ एक आयताकार आकार दर्शाती है.
- सीधे युक्तियों के साथ ठीक Dumont संदंश का प्रयोग, लगभग एक क्षैतिज स्थिति में, यह छील की तैयारी के एक छोर पर villi हथियाने और ऊतक के अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ दूर खींच द्वारा mucosa आसान है जब नमूना समान रूप से टिकी है, mucosa की रिबन कुछ व्यक्तिगत स्ट्रोक में अलग किया जा सकता है, submucosa है कि submucous ganglia और submucosal vasculature हैं उजागर.
- Plexuses के ठीक विच्छेदन के लिए, हम अंधेरे क्षेत्र रोशनी के साथ एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करने की सलाह देते हैं. दरअसल, छद्म तीन आयामी प्रभाव रोशनी के इस प्रकार के द्वारा बनाई गई व्यक्तिगत परतों भेद में मदद करता है, जिससे रोकने या नुकसान कम से कम साधन प्रवृत्त है.
- एक submucosal तैयारी करने के लिए, हम रेती और McKirdy 4 के शास्त्रीय प्रक्रिया की आवश्यकता है कि पालन करें:) परिपत्र मांसपेशी फाइबर के उन्मुखीकरण के बाद submucosal परत में कटौती कर रही है, यह बहुत ठीक कैंची का उपयोग (जैसे एक मोरिया के रूप में प्राप्त किया जा सकता है MC19 या इसके समकक्ष); ख) submucosa बहुत धीरे ठीक संदंश के साथ, हटाने, जबकि ठीक कैंची का उपयोग कर नीचे परिपत्र मांसपेशी परत धक्का ग) अनुदैर्ध्य किनारों के साथ काटने के रूप में जुदाई के बाकी हिस्सों से submucosa को आजाद कराने की प्रगति प्रस्तुत करने का, घ) पहले एक से एक दूरी पर परिपत्र मांसपेशी फाइबर, submucosal की तैयारी के अंतिम आकार को परिभाषित करने के उन्मुखीकरण के बाद एक दूसरे काट कर. परिणामस्वरूप submucosal खंड है, जो केवल 30 से 50 सुक्ष्ममापी मोटी है और एक पतला उपस्थिति है दूसरे Sylgard ताजा M199 - डीएम, टिकी धीरे और तनाव के बिना युक्त डिश के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है, और बाद में उपयोग के लिए एक oxygenated कक्ष में रखा.
- मूल आंत - खंड, अब mucosa और submucosa से वंचित है, और साथ परिपत्र मांसपेशी उजागर, अभी भी एक myenteric जाल तैयारी उपज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Myenteric जाल बेनकाब करने के लिए, एक खत्म करने के रूप में संभव के रूप में परिपत्र मांसपेशी परत के में ज्यादा चाहिए. यह वही सीधे टिप ठीक पिछले चरणों में कार्यरत संदंश का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है. फाइबर के बंडलों धीरे दूर खींच किया जा सकता है है, एक से पहले, और फिर तैयारी के दूसरी तरफ से. उजागर myenteric जाल मांसपेशियों और अंतर्निहित serosa के अनुदैर्ध्य परत से अलग नहीं किया जा सकता है. इसलिए, क्या myenteric जाल तैयारी बुलाया खंड है कि पिन के साथ काटा जा सकता है. क्योंकि यह जीना मांसपेशियों शामिल है, यह सलाह दी जाती है यह oxygenated M199-डीएम युक्त शारीरिक प्रयोग शुरू होता है है जब तक पकवान में बहुत शिथिल पिन.
- चूंकि mucosa मुख्य ENS संवेदक है, और सभी effectors भी पेट की दीवार में एम्बेडेड रहे हैं, यह संभव है अर्द्ध बरकरार तैयारी है कि पूरे पलटा रास्ते की रक्षा काटना. इन कस्टम डिजाइन की तैयारियाँ 1.3 में वर्णित चरणों के संयोजन की आवश्यकता होती है. 1.6. पृथक आंतों खंड के आसन्न क्षेत्रों के लिए लागू.
- वास्तविक ऑप्टिकल प्रयोग, चुनाव की तैयारी के लिए पहले कुछ मिनट प्रायोगिक कक्ष में मुहिम शुरू की है, सुनिश्चित करें कि तनाव समान रूप से वितरित किया जाता है और ऊतक Sylgard नीचे के खिलाफ पूरी तरह से फ्लैट झूठ है. इस एकाधिक बहुत ठीक पिंस कि ऊतकों को नुकसान inflicting बिना सभी परिधि के आसपास तैनात किया जा सकता है के साथ नमूना पकड़े द्वारा हासिल की है.
भाग 2: ऊतकों के नमूनों की ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग के लिए तैयार
- (वैकल्पिक) अवशिष्ट चिकनी मांसपेशियों और संयोजी ऊतक के लिए बाध्य डाई से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को रोकने के लिए, दोनों पृथक plexuses M199-डीएम में 30-60 मिनट collagenase (≤ 50 यू / एमएल) सातवीं और Protease ग्यारहवीं (≤ 0.5 μg युक्त के लिए incubated हो सकता है / एमएल). एंजाइम उपचार के बाद तैयारी के साथ धोया जा चाहिए, और बनाए रखा, M199-डीएम से अधिक 10% पशु सीरम (जैसे, घोड़े या गोजातीय) और एंटीबायोटिक दवाओं (पेनिसिलिन, 100U/ml, स्ट्रेप्टोमाइसिन, 100 μg / एमएल) रातोंरात एक में, चैम्बर वाई संतृप्तवें 95% 2 हे और 5% सीओ 2. यह प्रक्रिया है, जो हम कई वर्षों के लिए इस्तेमाल किया है क्योंकि यह ज़ाहिर ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग के संकेत से शोर अनुपात को बढ़ाता है beginners के लिए मददगार नहीं हो सकता है और सावधानी के साथ अपनाया जाना चाहिए सकता है. दरअसल, एक विच्छेदन के दौरान क्षतिग्रस्त तैयारी एंजाइम उपचार के दौरान बिखरने का खतरा चलाता है. हालांकि, एंजाइम उपचार के अभाव में भी, हम अनुशंसा करते हैं कि रात भर तैयारी M199-डीएम में सीरम और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ बनाए रखा जाना. यह कदम तीव्र विच्छेदन क्षति के बाद ऊतक चिकित्सा को बढ़ावा देता है, और नमूने की पारदर्शिता बढ़ जाती है.
- तैयारी में जो मांसपेशियों करार है में बिजली की गतिविधि के ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग हासिल नहीं किया जा सकता है. इसलिए, मांसपेशियों में संकुचन रोकने के लिए जब myenteric जाल, एक कुछ मिनट से पहले ऑप्टिकल प्रयोग हम M199 डीएम स्नान ऊतक 2 सुक्ष्ममापी nifedipine जोड़ने के लिए रिकॉर्डिंग.
भाग 3: di-4-ANEPPDHQ के साथ धुंधला
- डि 4 ANEPPDHQ वाणिज्यिक lyophilized रूप में उपलब्ध है. हम यह शुद्ध इथेनॉल में भंग, एक केंद्रित शेयर समाधान [उदाहरण के लिए, 15-20 मिलीग्राम / एमएल] की सिफारिश यह शेयर है, जब -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा है, बहुत ही स्थिर है. दरअसल, हमारी प्रयोगशाला में, हम सिर्फ इस डाई है कि हम लगभग 6 साल पहले बनाया था एक शेयर समाधान के अंतिम ड्रॉप समाप्त.
- M199-डीएम धुंधला समाधान तैयार किया जाना चाहिए, और 2 सुक्ष्ममापी nifedipine शामिल अगर यह प्रोटोकॉल की आवश्यकता चाहिए. डाई के अंतिम एकाग्रता 5 μg / मिलीलीटर रूप में के रूप में कम हो और 50 μg / मिलीलीटर से अधिक नहीं होना चाहिए कर सकते हैं. हालांकि, स्टॉक की एकाग्रता पर निर्भर करता है, इथेनॉल का एक निश्चित राशि धुंधला समाधान में मौजूद हो सकता है और ध्यान में रखा जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, 50 μg के मिलीलीटर / के साथ एक धुंधला समाधान डाई ~ 0.3% इथेनॉल शामिल होंगे अगर एक 15 शेयर मिलीग्राम / एमएल से बना है, लेकिन करीब 1% इथेनॉल अगर केवल 5 मिलीग्राम / एमएल के एक एकाग्रता के शेयर था.
- धुंधला के लिए, तैयारी डाई समाधान में 10-30 मिनट के लिए डूबे हुए है. उस अवधि के बाद, डाई दूर धोया जाता है और ताजा द्वारा बदल दिया है, M199-डीएम oxygenated. चूंकि di-4-ANEPPDHQ झिल्ली impermeant fluoresces है कि केवल एक लिपिड वातावरण में जब एक रंग है, एक दाग अंत्र तैयारी से स्वस्थ न्यूरॉन्स खाली गुब्बारे की उपस्थिति होनी चाहिए.
भाग 4: बिजली उत्तेजना
- उत्तेजना वोल्टेज या वर्तमान द्वारा संचालित किया जा सकता है है. हम वर्तमान उत्तेजना, चैनल प्रति 16 मा के एक अधिकतम उत्पादन के साथ, उत्तेजना जनरेटर 4 चैनल नियंत्रित कंप्यूटर द्वारा दिया उपयोग करें.
- इलेक्ट्रोड के लिए भी प्रयोग में इस्तेमाल किया जा मॉडल प्रयोगात्मक उद्देश्य से निर्धारित होता है. Intracellular pipettes या पैच इलेक्ट्रोड जब लक्ष्य एक विशेष न्यूरॉन की उत्तेजना है इस्तेमाल किया जा सकता है. जब उत्तेजना के लिए एक दिया नाड़ीग्रन्थि में एक से अधिक न्यूरॉन सक्रिय करने का इरादा है, एक बाह्य एक संयोजी छू इलेक्ट्रोड का इस्तेमाल किया जा सकता है. परस्पर ganglia, बड़े, कम प्रतिरोध इलेक्ट्रोड और / या बहु तत्व इलेक्ट्रोड सरणियों नियोजित किया जा सकता का अध्ययन करने के लिए, तथापि, जब वर्तमान उत्तेजना का उपयोग कर के रूप में हम आम तौर पर करते हैं, बहु - तत्व arrays ही एकमात्र विकल्प बन जाते हैं. कोशिकी इलेक्ट्रोड, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कुछ रैखिक इलेक्ट्रोड arrays, के कई मॉडल वाणिज्यिक स्रोतों से आसानी से उपलब्ध हैं.
- इलेक्ट्रोड micromanipulators के विभिन्न प्रकार का उपयोग कर तैनात किया जा सकता है. लंबे और ठीक बैरल द्वारा प्रेरित कंपन से बचने के लिए, हम चुंबकीय अड्डों है कि प्रायोगिक कक्ष के निकट तैनात किया जा सकता है पर छोटे micromanipulators का उपयोग पक्ष है, और पतली, लेकिन बहुत कठोर धातु सलाखों के साथ tungsten इलेक्ट्रोड का लचीला बैरल का समर्थन.
भाग 5: परफ्यूज़न
हम oxygenated समाधान के इनपुट के लिए एक चैनल, और अन्य उत्पादन के लिए के साथ एक 2 चैनल क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग करें. छिड़काव द्वारा प्रेरित यांत्रिक गड़बड़ी को खत्म करने के लिए, ऑप्टिकल डेटा के अधिग्रहण के दौरान पंप चालू बंद है.
भाग 6: झिल्ली क्षमता के एकाधिक साइट ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग के लिए उपकरण
- ऑप्टिकल घटकों:
झिल्ली क्षमता के एकाधिक साइट ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग के लिए तंत्र एक NeuroCCD एस.एम. (RedShirtImaging) कैमरा और एक 1:10 / demagnifier रिले लेंस एक ईमानदार माइक्रोस्कोप की trinocular ट्यूब पर घुड़सवार शामिल हैं. खुर्दबीन एक XY अनुवादक पर चलता है, स्वतंत्र रूप से एक मंच है कि rigidly एक सक्रिय कंपन अलगाव तालिका के शीर्ष करने के लिए तय हो गई है. हवाई कंपन को कम करने के लिए, पूरे तंत्र भारी ध्वनिक पर्दे और एक mylar छत से घिरा हुआ है. महामारी रोशनी एक 100W टंगस्टन हलोजन एक अल्ट्रा कम तरंग प्रतिक्रिया स्थिर बिजली की आपूर्ति के द्वारा संचालित दीपक द्वारा प्रदान की गई है. घटना प्रकाश अर्ध रंग का बना एक गर्मी फिल्टर, एक उच्च क्यू हस्तक्षेप फिल्टर (HQ530/50) और एक 565 एनएम (50% संचरण) dichroic दर्पण का उपयोग. प्रतिदीप्ति उत्सर्जन dichroic दर्पण और एक लंबे समय के पास फिल्टर (HQ572LP) का उपयोग करने के लिए अलग है. इरादेघटना प्रकाश का sity तटस्थ घनत्व फिल्टर का उपयोग करने के लिए निकाला जाता है. ट्रांस रोशनी, तैयारी के उज्ज्वल क्षेत्र देखने के लिए एक दूसरे 100 डब्ल्यू टंगस्टन हलोजन वी 0-55, 1-10 है कि किसी विशेष विशेषताओं के अधिकारी की आवश्यकता नहीं है एक बिजली की आपूर्ति के द्वारा संचालित दीपक द्वारा प्रदान की गई है. - उच्च गति कैमरा विनिर्देशों:
NeuroCCD - एस.एम. कैमरा के इलेक्ट्रॉनिक डिजाइन और प्रदर्शन विशेषताओं 3 में विस्तार से वर्णित किया गया है. संक्षेप में, यह एक ठंडा, कम संकल्प, सटीक उच्च गति कैमरा है कि वापस thinned का उपयोग करता है है, मारकोनी चिप CCD39-01 पीछे से प्रबुद्ध (80x80 पिक्सल). डिजिटलीकरण 14 - बिट है, और पूर्ण फ्रेम दर 2 kHz है. हालांकि, विशिष्ट प्रयोजनों के लिए, एक फ्रेम दर को बढ़ाने के विभिन्न binning संयोजन का उपयोग कर या कार्यात्मक पिक्सेल की संख्या को कम करने के द्वारा हो सकता है और 10 kHz के एक अधिकतम करने के लिए. कैमरा बेहद कम पढ़ा शोर (, 1 kHz पर 9 इलेक्ट्रॉनों 2 kHz पर 23 इलेक्ट्रॉनों) के महत्वपूर्ण लाभ है. इसके अलावा, अपने पिक्सल एक अपेक्षाकृत बड़ी अच्छी तरह से गहराई (215.000 इलेक्ट्रॉनों) है, उच्च फ्रेम दर पर मध्यम प्रकाश तीव्रता की अनुमति है. - डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर:
ऑप्टिकल प्रयोग Neuroplex द्वारा नियंत्रित है, एक सॉफ्टवेयर पैकेज है कि RedShirtImaging से, आईडीएल मंच (इंटरएक्टिव डेटा भाषा) के भीतर एक आवेदन के रूप में चलाता है और एकाधिक अधिग्रहण, और ऑप्टिकल डेटा का प्रदर्शन के विश्लेषण के लिए आवश्यक सुविधाओं में शामिल हैं. - अतिरिक्त कैमरा:
तंत्र का एक अभिन्न हिस्सा है, एक दूसरे, उच्च संकल्प सीसीडी कैमरा एक फ्रेम धरनेवाला के लिए जुड़ा पर खुर्दबीन तैयारी की एक छवि रिले के trinocular सिर पर एक बीम फाड़नेवाला के रूप में. छवि, जो हासिल कर ली है और ग्लोबल लैब सॉफ्टवेयर छवि / 2 का उपयोग संग्रहीत उप millisecond के प्रदर्शन पर आरोपित NeuroCCD-SM कैमरे द्वारा कब्जा कर लिया ऑप्टिकल संकेतों के स्थानिक मूल के एक सटीक मानचित्र उत्पन्न करने के लिए हल किया जा सकता है ऑप्टिकली वोल्टेज संकेतों दर्ज है. हमारी प्रयोगशाला में, इस कैमरे के लिए फ्रेम धरनेवाला कार्यात्मक डेटा अधिग्रहण के लिए जिम्मेदार एक की तुलना में एक अलग कंप्यूटर में रहता है. इसलिए, छवि फ़ाइल के लिए एक कंप्यूटर से दूसरे करने के लिए हस्तांतरित किया जा है, और आकार और उच्च संकल्प छवि की स्थिति में छोटे समायोजन से पहले दो कैमरों का सही पंजीकरण हासिल की है आवश्यक हैं.
भाग 7: ऑप्टिकल प्रयोगों
- प्रत्येक कार्यात्मक रिकॉर्डिंग के लिए पहले, हम उच्च संकल्प जो इस क्षेत्र से हम ऑप्टिकल माध्यम से विद्युत गतिविधि रिकॉर्ड (6.4 में संकेत के रूप) योजना के काले और सफेद छवि का अधिग्रहण. यह छवि, जब पिक्सेल उच्च गति कैमरा के नक्शे पर आरोपित, हमें संरचनाओं कि ऑप्टिकल संकेतों के स्रोत रहे हैं की पहचान करने में मदद करता है.
- उचित सिस्टम विन्यास में, Neuroplex (6.3 देखें) भी शटर नियंत्रण, और बिजली की उत्तेजना से चलाता है. उच्च गति डाटा अधिग्रहण के बाद से काफी कंप्यूटर को बिजली की आवश्यकता है, यह सलाह दी जाती है, अगर सब संभव हो पर हो, स्मृति की एक बड़ी राशि और एक उच्च क्षमता हार्ड ड्राइव के साथ एक समर्पित कंप्यूटर का उपयोग करें. यही है, तथापि, तुच्छ नहीं है. हमारी अपनी प्रणाली है, उदाहरण के लिए, पहले से ही कई वर्षों के पुराने, डाटा अधिग्रहण बोर्डों कि राज्य के-the-कला कंप्यूटर में फिट भी बड़ी हैं कार्यरत हैं. एक समझौते के रूप में, हम अपनाया और हमारे ऑप्टिकल प्रणाली एक DELL 390 प्रेसिजन एक 500 जीबी हार्ड ड्राइव और रैम की 4 जीबी के साथ सुसज्जित करने के लिए समर्पित है. इस कंप्यूटर हमें हमारे बड़े, लेकिन पर्याप्त, ए / डी और डी / एक बोर्डों रखने के लिए अनुमति दी, जबकि अभी भी हमारे प्रयोगों को चलाने के लिए पर्याप्त बिजली उपलब्ध कराने.
- जैसे ही अधिग्रहण खत्म हो गया है, Neuroplex कई पूरक स्वरूपों में परिणाम प्रदर्शित कर सकते हैं, जिनमें से कुछ नीचे विस्तृत रहे हैं:
- स्क्रीन के एक क्षेत्र बुलाया पृष्ठ प्रदर्शन के रूप में एक व्यक्ति के फ्रेम के रूप में 80x80 उच्च गति कैमरा द्वारा कब्जा की तैयारी के कच्चे छवि से पता चलता है. इस दूसरा कैमरा (के रूप में 6.4 और 7.1 में विस्तार से बताया) के साथ प्राप्त उच्च संकल्प छवि के पिक्सेल नक्शे पर superposition एस ऑपरेटर के लिए हित के क्षेत्रों की पहचान करने की क्षमता refines.
- जब यह पृष्ठ प्रदर्शित करने के पिक्सल माउस नियंत्रण के तहत चयनित हैं, Neuroplex स्वचालित रूप से निशान है कि ऑप्टिकल समय के एक समारोह के रूप में उन पिक्सल द्वारा पंजीकृत परिवर्तन की भयावहता दिखाने में उनके ऑप्टिकल outputs के धर्मान्तरित. (उदाहरण के लिए, / ΔF एफ बनाम समय). ऑपरेटर तय कर सकते हैं कि क्या इन निशान व्यक्तिगत पिक्सल के उत्पादन, या, बल्कि, तैयारी का एक दिया क्षेत्र पर अंतरिक्ष औसतन एकाधिक loci के उत्पादन को प्रतिबिंबित करना चाहिए.
- डेटा भी फिल्म स्वरूप में प्रदर्शित किया जा सकता है.
सुनिश्चित करें कि सभी व्यक्तिगत प्रयोगात्मक रन में निहित जानकारी पूरी तरह से निकाला जाता है, तथापि, हम ऑप्टिकल डेटा का विश्लेषण बंद लाइन एहसान. इस विश्लेषण के प्रतिनिधि परिणाम उपलब्ध हैं.
भाग 8: कैसे एक ऑप्टिकल प्रयोग में तकनीकी गुणवत्ता हासिल करने के लिए
गुई एक ऑप्टिकल प्रयोग के तकनीकी सफलता मापा जाता है, अंततः संकेत रिकॉर्डिंग के शोर अनुपात द्वारा. इसके अलावा, एक अच्छा संकेत से शोर अनुपात एक घोषणा से नहीं बल्कि एक यात्रा से उपजा है. एक ओपेरा के प्रदर्शन में के रूप में, अंतिम परिणाम कारकों कि synergistically बातचीत की बहुलता के द्वारा निर्धारित किया जाता है. इस प्रकार, एक तकनीकी ध्वनि ऑप्टिकल प्रयोग प्राप्त करने के लिए, यह आवश्यक है परिष्कृत करने के लिए, स्वतंत्र, ऑप्टिकल उपकरण और प्रोटोकॉल के प्रत्येक व्यक्ति के कदम के लिए आवश्यक कौशल. इसके बाद संभावित मुसीबत क्षेत्रों की एक सूची है, और 5 हमेशा से प्रत्याशित नहीं समस्याओं से बचने के लिए कुछ सुझाव:
- शोर स्रोतों
यांत्रिक और ऑप्टिकल स्थिरता महत्वपूर्ण हैं जब वोल्टेज के प्रति संवेदनशील रंगों के साथ बिजली की गतिविधि रिकॉर्डिंग, क्योंकि भिन्नात्मक परिवर्तन (ΔF / एफ) शारीरिक प्रतिक्रियाओं को दर्शाती अपेक्षाकृत छोटा है (<% 10 / आंत रिकॉर्डिंग के अधिकांश में 100 mV) और एक शोर ट्रेस हमेशा एक बुरा परिणाम शुभ संकेत है. इसलिए, संकेत से शोर अनुपात का अनुकूलन करने के लिए, यह को खत्म करने के लिए जरूरी है, या कम से कम, कम से कम दो सबसे खराब अपराधियों के योगदान:) यांत्रिक कंपन, और ख) प्रकाश स्रोत अस्थिरता.- यांत्रिक कंपन सूत्रों की एक किस्म के द्वारा सेटअप विन्यास, स्थिरता की निकटता, motorized उपकरण, हवा धाराओं, ध्वनिक शोर, द्रव गति, या स्नान समाधान में तैरते कणों के निर्माण के रूप में विविध रूप में उत्पन्न कर रहे हैं. एक अच्छा प्रणाली कंपन अलगाव, और चरम मामलों के लिए ध्वनिक पर्दे (देखने के लिए, उदाहरण के लिए, 5.1 में वर्णन), एक बड़ा फर्क कर रहे हैं और अच्छी तरह से उनकी लागत के लायक है. इसके अलावा, प्रयोग, या सेटअप के छोटे, जंगम भागों के लिए चुंबकीय अड्डों के इस्तेमाल में प्रयोग किया जाता के समाधान के निस्पंदन के रूप में आम - भावना दृष्टिकोण, काफी प्रभावी हैं.
- लाइट सूत्रों अर्ध - अधिक से अधिक तीव्रता में सबसे अधिक स्थिर हैं. इसलिए, एक बिजली की आपूर्ति के लिए एक मौजूदा सीमा निर्धारित करते हैं, करना चाहिए और जब आवश्यक हो, प्रकाश की तीव्रता को कम वोल्टेज कम करने के बजाय प्रकाश पथ में तटस्थ घनत्व फिल्टर को सम्मिलित करके. आर्क लैंप आंतरिक रूप से शोर कर रहे हैं. टंगस्टन हलोजन बल्ब या प्रकाश उत्सर्जक डायोड अधिक स्थिर हैं और पसंदीदा 6 विकल्प होना चाहिए.
- पशु उम्र
Dissections युवा पशुओं के पेट का उपयोग किया जाना चाहिए, क्योंकि उम्र के साथ पेट toughens के भीतर संयोजी ऊतक के रूप में इसे और अधिक मुश्किल हो जाता है दो plexuses के न्यूरॉन्स, जिसका अभिवाही और अपवाही प्रक्रियाओं सकता है पर प्रमुख नुकसान inflicting बिना व्यक्तिगत ऊतक परतों अलग पार परत सीमाओं और / या पेट के अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ काफी दूरी के लिए परियोजना. इस सलाहकार, जो जब अंतर ganglionic कनेक्शन का अध्ययन अवहेलना किया जा सकता है सर्वोपरि महत्व का है जब प्रयोगात्मक उद्देश्य अंतर ganglionic सर्किट या पलटा रास्ते के सक्रियण के विश्लेषण है. - डाई internalization
यह महत्वपूर्ण है कम संभव के रूप में एक डाई एकाग्रता के रूप में उपयोग करते हैं, और अनावश्यक प्रकाश जोखिम को कम. हालांकि di-4-ANEPPDHQ बहुत कम अन्य रंगों की तुलना में phototoxic साबित हो गया है, यह भली भाँति मिल जाएगा अंततः, के रूप में तैयारी के स्वास्थ्य कमजोर होती है. डाई internalization नाटकीय रूप से पृष्ठभूमि 3 प्रतिदीप्ति बढ़ाने के संकेत से शोर अनुपात घटता है . - इलेक्ट्रोड रखरखाव
- इलेक्ट्रोड एक प्रयोग के बाद सावधानी से और अच्छी तरह से धोया जाना चाहिए. Tungsten इलेक्ट्रोड के सुझावों पर कार्बनिक जमा इलेक्ट्रोड प्रतिरोध बढ़ाने के लिए और उत्तेजना को रोकने.
- व्यावसायिक रूप से उपलब्ध टंगस्टन इलेक्ट्रोड के इन्सुलेशन बहुत नाजुक है और नुकसान होने का खतरा है. इन्सुलेशन में एक रिसाव वर्तमान अलग धकेलना, उत्तेजना की प्रभावशीलता के साथ समझौता होगा और प्रयोग की सफलता को ख़तरे में डालना.
- छिड़काव खतरों
छोड़ जबकि छिड़काव पर है कभी पहुंच से बाहर सेट अप. यदि प्रवाह और क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप के बाहर प्रवाह अच्छी तरह से संतुलित नहीं कर रहे हैं, दो भयावह घटनाओं जगह ले सकता है:- बाढ़ खुर्दबीन के लिए अपरिवर्तनीय क्षति का कारण हो सकता है.
- तैयारी प्रयोग के दौरान बाहर सूखी हो सकता है.
- सॉफ्टवेयर परेशानियों
यह सॉफ्टवेयर है कि के रूप में अच्छी तरह के रूप में अधिग्रहण विश्लेषण नियंत्रण के साथ अपने परिचित आवश्यक है. तेजी से डाटा अधिग्रहण और / या बहुत बड़ी फ़ाइलों के निर्माण के टूटने के कगार करने के लिए प्रणाली ड्राइव करते हैं, और Neuroplex, जो काफी माफ है लगातार दुर्घटना जब तक अपनी सीमा शर्तों का सम्मान कर रहे हैं. रिकॉर्ड के भीतर subtleties, आसानी से याद है जब विश्लेषण हित के सीमित क्षेत्रों तक ही सीमित है, अक्सर खुद को डेटा की फिल्म प्रदर्शित करता है में प्रकट करते हैं.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल के मन में दो लक्ष्यों के साथ लिखा गया है. पहले एक अन्य जांचकर्ताओं को मनाने कि, पिछले दशक के कई प्रौद्योगिकीय अग्रिमों, बिजली वोल्टेज के प्रति संवेदनशील रंगों का उपयोग गतिविधि के ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग के लिए धन्यवाद बरकरार neuronal नेटवर्क अध्ययन के लिए सबसे शक्तिशाली, विश्वसनीय और सस्ती तरीके बन गया है, वास्तव में , यह एक मामूली संसाधनों होने प्रयोगशाला में आसानी से किया जा सकता है भी कार्यान्वित. दूसरा लक्ष्य के लिए एक अद्वितीय प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में आंतों का तंत्रिका तंत्र जिसमें दो neuronal plexuses और उनके जैविक outputs के बिजली के व्यवहार के साथ आणविक और सेलुलर घटनाओं सहसंबंधी करने के लिए बढ़ावा देना है.
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Acknowledgments
हम डीए कल्टर (काट) हमें अपने 2-photon माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए हमारे साथ अपनी तकनीकी विशेषज्ञता को साझा करने के लिए 2-photon वीडियो की शुरुआत में दिखाया गया है छवियों, और एच. Takano प्राप्त करने की अनुमति देने के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M3769 | With Earle’s salts Without L-Glutamine, Phenol Red and Sodium Bicarbonate |
| Sylgard | Dow Corning | 184 silicone elastomer kit | |
| Insect pins used for dissection | F.S.T. | 26001-30 | |
| Dumont forceps | F.S.T. | 11203-23 or 11200-33 | |
| Moria MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | F.S.T. | 15371-92 | |
| Pins to hold the tissue during the experiment | Seirin Corp. | Seirin Spinex | |
| Collagenase VII | Sigma-Aldrich | C0773 | |
| Protease IX | Sigma-Aldrich | P6141 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10439-016 | |
| PenStrep | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| L-Glutamine 100X | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Nifedipine | Sigma-Aldrich | ||
| Di-4-ANEPPDHQ | Molecular Probes, Life Technologies | D36802 | |
| 4-Channel Stimulus Generator | Multi Channel System MCS GmbH | 2000 Series | |
| Peristaltic pump | Rainin | 2-channel Dinamax RP-1 | |
| High-speed camera | RedShirtImaging, LLC | NeuroCCD-SM | |
| 1:10 demagnifier / relay lens | Optem, Qioptiq Inc. | ||
| Upright microscope | Olympus Corporation | BX61TRF | |
| Gibraltar fixed stage with motorized X-Y translator | Gibraltar, Burleigh Instruments, EXFO, Quebec, Canada | PSSG--BX2 | |
| Linear matrix electrodes | FHC, Inc. | Custom made | |
| Active vibration-isolation table | Halcyonics,Inc., Menlo Park, CA | Micro 60 | |
| Ultra-low-ripple feedback stabilized power supply | Kepco, Flushing, NY | ATE 75-15M | |
| Heat filter | Schott AG | KG-1 | |
| High-Q interference filter | Chroma Inc. | HQ530/50 | |
| Dichroic mirror | Chroma Inc. | 565 nm (50% transmission) | |
| Long-pass filter | Chroma Inc. | HQ572LP | |
| Acoustic curtains | Acoustical Surfaces, Inc. | BSC-25 | |
| Neuroplex | RedShirtImaging, LLC | ||
| IDL | ITT Visual Information Solutions | ||
| High-resolution CCD camera, with its own camera controller | Hamamatsu Corp. | ||
| Frame-grabber for high-resolution camera | Data Translation | DT3120K-1 | |
| Imaging software for high-resolution camera | Data Translation | Global Lab Image/2 |
References
- Johnson, L. eonard R. in Physiology of the Gastrointestinal Tract, edited by Leonard R. , Raven Press. New York. 1-1 (1987).
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