Summary
Dieses Protokoll zeigt, wie Spannungs-sensitiven Farbstoffen optische Erfassung der elektrischen Aktivität ermöglichen aus intakten neuronalen Netzen wie dem Plexus des Meerschweinchens enterale Nervensystem, mit einer einstellbaren Auflösung reicht von Einzel-Zellen zu multi-ganglionären Schaltung.
Abstract
Die enterale Nervensystem (ENS) ist ein in sich geschlossenes Netzwerk mit identifizierten Funktionen, ausführen kann komplexe Verhaltensweisen in Isolation. Seine Neuronen (10 bis 25 &mgr; m Durchmesser) sind in Geflechten, die verschiedene Ebenen der Darmwand beschränkt sind so angeordnet
Protocol
Teil 1: Tissue Vorbereitung
- Die submuköse und Plexus myentericus Vorbereitungen sind durch sequentielle Dissektion aus dem Dünndarm von 150-200g (2-3 Wochen alt) Hartley Meerschweinchen, die betäubt wurden von Isofluran beim Einatmen und enthauptet isoliert. Nach Euthanasie, ist der Dünndarm herausgeschnitten und deren Inhalt durch Spülen des Lumens mit einem warmen, sauerstoffreichen Lösung entfernt. Wir verwenden Medium 199 mit 25 mM HEPES, 5 mM NaHCO 3 und 2 mM Glutamin und pH-Wert auf 7,4 (nach, von nun an als M199-DM), die wurde bei 37 vorgewärmten ° C ergänzt Alle übrigen Schritte des Protokolls, wird aber bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
- Ein Darm-Segment, 8-10 cm in der Länge, ist eine Sylgard Schale mit M199-DM, entlang der mesenterialen Grenze geöffnet übertragen und montiert Schleimhaut side-up mit Insekten Pins. Es ist äußerst wichtig, um eine gleichmäßige Spannung zu halten, so dass nach Pinning das Gewebe eine rechteckige Form aufweist mit den Zeilen der Schleimhaut Zotten regelmäßig ausgerichtet.
- Mit feinen Dumont Zange mit geraden Spitzen, in eine fast waagerechte Position, ist es leicht zu schälen die Schleimhaut durch Greifen der Zotten an einem Ende der Vorbereitung und Anfahren entlang der Längsachse des Gewebes. Wenn die Probe gleichmäßig merken können Bänder der Schleimhaut in ein paar einzelnen Strichen getrennt werden, Freilegung der Submukosa, dass die submukösen Ganglien und der submukösen Blutgefäße enthält.
- Für die feinen Sezierung des Plexus, empfehlen wir die Verwendung eines Binokular mit Dunkelfeldbeleuchtung. In der Tat hilft die pseudo dreidimensionale Wirkung durch diese Art der Beleuchtung geschaffen, um die einzelnen Schichten zu unterscheiden, wodurch verhindert oder minimiert Instrument zugefügte Schäden.
- Um eine submuköse Vorbereitung, folgen wir dem klassischen Verfahren von Hirst und McKirdy 4, erfordert: a) macht einen Schnitt in der Submukosa nach der Ausrichtung der Ringmuskelfasern; dies erreicht mit sehr feinen Schere (z. B. ein Moria MC19 oder dessen Äquivalent), b) die Aufhebung der Submukosa sehr vorsichtig mit dem feinen Pinzette, während Sie die Ringmuskelschicht sich mit der feinen Schere; c) Schneiden entlang der Längskanten als die Trennung schreitet der Submukosa aus dem Rest der Befreiung prep, d) einen zweiten Schnitt nach der Ausrichtung der Ringmuskelfasern in einem Abstand von der ersten, auf die endgültige Größe des submukösen Vorbereitung definieren. Die daraus resultierende submukösen Segment, die nur 30 bis 50 mu m dick ist und hat einen hauchdünnen Aussehen, kann auf einen anderen Sylgard Schüssel mit frischem M199-DM, merken sich sanft und ohne Zug übertragen werden, und hielt in einem sauerstoffreichen Kammer für die spätere Verwendung.
- Die ursprüngliche gut-Segment nun Mukosa und Submukosa beraubt und mit dem Ringmuskel ausgesetzt ist, kann immer noch verwendet, um einen Plexus myentericus Vorbereitung zu ergeben. Zur Freilegung des Plexus myentericus, muss man so viel wie möglich von der Ringmuskelschicht zu beseitigen. Dies kann durch Verwendung derselben Geraden-Spitze feinen Pinzette in den vorherigen Schritten beschäftigt erreicht werden. Faserbündel kann sanft weggezogen werden, zuerst von einem, und dann von der anderen Seite der Zubereitung. Die exponierte Plexus myentericus kann nicht von der Längs-Schicht aus Muskeln und die zugrunde liegende Serosa getrennt werden. Daher sogenannten Plexus myentericus Vorbereitung ist das Segment, das entlang der Stifte geschnitten werden können. Weil es Live-Muskel enthält, ist es ratsam, es ist sehr lose Bolzen in die Schüssel mit Sauerstoff M199-DM, bis die physiologische Experiment beginnt.
- Da die Schleimhaut ist die wichtigste ENS-Sensor, und alle Effektoren sind auch in der Darmwand eingebettet sind, ist es möglich, semi-intakten Präparate, die gesamte Reflexbahnen bewahren zu sezieren. Diese maßgeschneiderten Vorbereitungen erfordern Kombinationen der Schritte in 1.3 beschrieben. bis 1,6., angewandt auf den angrenzenden Gebieten der isolierten Darm-Segment.
- Ein paar Minuten vor dem eigentlichen optischen Experiment, die Vorbereitung der Wahl ist in der experimentellen Kammer angebracht, um sicherzustellen, dass die Spannung gleichmäßig verteilt ist und das Gewebe liegt ganz flach an die Sylgard unten. Dies ist, indem die Probe mit mehreren sehr feinen Nadeln, die alle um den Umfang ohne zuzufügen Gewebeschäden positioniert werden können, erreicht.
Teil 2: Herstellung von Gewebeproben für die optische Aufzeichnung
- (Optional) Um die Hintergrund-Fluoreszenz-Farbstoff-Bindung an Rest-glatten Muskulatur und des Bindegewebes zu verhindern, können sowohl isolierte Plexus für 30-60 min in M199-DM mit Collagenase VII (≤ 50 U / ml) und Protease IX (≤ 0,5 ug inkubiert werden / ml). Nach der Enzymbehandlung die Vorbereitungen sollten gewaschen und gewartet werden über Nacht in, M199-DM plus 10% tierischem Serum (z. B. Pferde oder Rinder) und Antibiotika (Penicillin, 100U/ml; Streptomycin, 100 ug / ml) in einer Kammer gesättigten with 95% O 2 und 5% CO 2. Dieses Verfahren, das wir seit vielen Jahren eingesetzt haben, weil es erhöht deutlich das Signal-Rausch-Verhältnis der optischen Aufnahmen, möglicherweise nicht hilfreich für Anfänger und sollte nur mit Vorsicht angenommen werden. In der Tat läuft eine Zubereitung beim Präparieren beschädigt das Risiko der Desintegration bei der Enzymbehandlung. Aber auch in der Abwesenheit der Enzymbehandlung, empfehlen wir, dass die Vorbereitungen über Nacht in M199-DM aufrechterhalten werden mit Serum und Antibiotika. Dieser Schritt fördert die Heilung des Gewebes nach einer akuten Dissektion Beschädigungen und erhöht die Transparenz der Probe.
- Optische Aufnahmen von elektrischen Aktivität kann nicht in einer Zubereitung in der der Muskel zusammenzieht erreicht werden. Deshalb, um zu verhindern Muskelkontraktion bei der Aufnahme aus dem Plexus myentericus, ein paar Minuten vor dem optischen Experiment, das wir hinzufügen, 2 uM Nifedipin auf die M199-DM baden das Gewebe.
Teil 3: Färbung mit di-4-ANEPPDHQ
- Di-4-ANEPPDHQ ist im Handel erhältlich in gefriergetrockneter Form. Wir empfehlen Auflösen in reinem Ethanol, wodurch eine konzentrierte Stammlösung [zB 15-20 mg / ml]. Dieser Bestand, bei -20 ° C gehalten wird, ist äußerst stabil. In der Tat, in unserem Labor haben wir soeben die letzten Tropfen einer Stammlösung dieses Farbstoffs, dass wir fast 6 Jahren gemacht hatte.
- Die Färbelösung ist in M199-DM vorbereitet werden, und sollte 2 uM Nifedipin enthalten, wenn das Protokoll erfordert. Die endgültige Konzentration des Farbstoffes kann so niedrig wie 5 ug / ml und sollte nicht höher sein als 50 pg / ml. Allerdings, je nach der Konzentration der Lager ist, wird eine bestimmte Menge an Ethanol in der Färbelösung und sollten berücksichtigt werden. Zum Beispiel, einer Färbelösung mit 50 ug / ml Farbstoff ~ 0,3% Ethanol enthalten, wenn aus einer 15 mg / ml an Lager haben, aber nahe bei 1% Ethanol, wenn die Aktie hatte eine Konzentration von nur 5 mg / ml.
- Zur Färbung wird das Präparat für 10-30 Minuten in die Farbstofflösung getaucht. Nach Ablauf dieser Frist, den Farbstoff entfernt und durch frisches ersetzt gewaschen, mit Sauerstoff M199-DM. Da di-4-ANEPPDHQ ist eine Membran-impermeante Farbstoff, der nur dann, wenn in einer Lipid-Umgebung fluoresziert, sollten gesunde Neuronen aus einem gefärbten magensaftresistenten Vorbereitung haben das Aussehen von leeren Sprechblasen.
Teil 4: Elektrische Stimulation
- Stimulation kann durch Spannung oder Strom angetrieben werden. Wir verwenden aktuelle Stimulation durch einen Computer gesteuert, 4-Kanal-Impuls-Generator mit einer maximalen Leistung von 16 mA pro Kanal geliefert.
- Die Elektrode Modell in einem bestimmten Experiment eingesetzt werden wird durch die experimentelle Ziel bestimmt. Intrazelluläre Pipetten-oder Patch-Elektroden können verwendet werden, wenn das Ziel ist die Stimulation eines bestimmten Neurons werden. Wenn die Stimulation dazu bestimmt ist, mehr als ein Neuron in einer bestimmten Ganglion aktivieren, kann eine extrazelluläre Elektrode berührt ein verbindendes verwendet werden. Zur Vernetzung Ganglien, groß, mit niedrigem Widerstand Elektroden und / oder Multi-Element-Elektroden-Arrays eingesetzt werden kann studieren, aber bei der Verwendung von Reizstrom, wie wir in der Regel tun, werden Multi-Element-Arrays die einzige Option. Viele Modelle von extrazellulären Elektroden, sowie einige lineare Elektroden-Arrays sind leicht aus kommerziellen Quellen erhältlich.
- Elektroden positioniert Verwendung unterschiedlicher Arten von Mikromanipulatoren werden. Um zu vermeiden, die Vibrationen, die durch lange und feine Barrel induziert, favorisieren wir mit kleinen Mikromanipulatoren auf magnetischen Basen, angrenzend an die experimentelle Kammer werden kann, und unterstützt die flexible Barrel der Wolfram-Elektroden mit dünnen, aber sehr steif Metallstangen.
Teil 5: Perfusion
Wir verwenden eine 2-Kanal-Schlauchpumpe mit einem Kanal für die Eingabe von Sauerstoff-Lösungen, und die andere für die Ausgabe. Um mechanische Störungen durch die Perfusion induziert beseitigen, wird die Pumpe eingeschaltet ist-off bei der Akquisition der optischen Daten.
Teil 6: Geräte für mehrere Seiten optischen Aufnahme des Membranpotentials
- Optische Komponenten:
Das Gerät für mehrere Seiten optischen Aufzeichnung von Membranpotential besteht aus einem NeuroCCD-SM-Kamera (RedShirtImaging) und ein 1:10 demagnifier / Relais-Linse auf der Trinokulartubus von einem aufrechten Mikroskop montiert. Das Mikroskop bewegt sich auf einem XY-Übersetzer, unabhängig von einer Bühne, die starr an der Spitze einer aktiven Schwingungsisolation Tisch befestigt ist. Zur Minimierung der Luft Vibration, ist die gesamte Vorrichtung durch schwere akustische Vorhänge und eine Mylar-Dach umgeben. Epi-Beleuchtung wird durch eine 100W Halogenlampe mit einem Ultra-Low-Ripple-Feedback stabilisiert Netzteil mit Strom versorgt Verfügung gestellt. Das einfallende Licht wird quasi-monochromatische mit einem Wärme-Filter, eine high-Q Interferenzfilter (HQ530/50) und 565 nm (50% Transmission) dichroitischen Spiegel. Fluoreszenzemission ist getrennt durch den dichroitischen Spiegel und eine lange-Pass-Filter (HQ572LP). Die intensität des einfallenden Lichts wird mit Hilfe Neutralfilter. Trans-Beleuchtung ist für Hellfeld-Anzeige von der Vorbereitung durch eine zweite 100 W Wolfram-Halogen-Lampe durch eine 0-55 V, 1-10 A-Stromversorgung, die nicht erforderlich ist, besondere Eigenschaften besitzen angetrieben wird. - High-Speed-Kamera-Spezifikationen:
Die Elektronik-Design und die Leistungsmerkmale der NeuroCCD-SM-Kamera im Detail 3 beschrieben. Kurz gesagt, ist es eine gekühlte, niedrige Auflösung, Präzision High-Speed-Kamera, die die Back-ausgedünnt verwendet, Marconi CCD39-01-Chip hinten beleuchteten (80x80 Pixel). Digitalisierung ist 14-bit und die volle Bildrate 2 kHz. Für bestimmte Zwecke kann man erhöhen die Frame-Rate bis zu einem Maximum von 10 kHz unter Verwendung von verschiedenen Binning-Kombinationen oder die Verringerung der Anzahl der funktionellen Pixel. Die Kamera hat den wichtigen Vorteil der extrem niedrigen lesen Lärm (23 Elektronen bei 2 kHz; 9 Elektronen bei 1 kHz). Darüber hinaus haben die Pixel eine relativ große und Tiefe (215.000 Elektronen) und ermöglicht moderate Lichtintensitäten bei hohen Bildraten. - Datenerfassung und Analyse-Software:
Das optische Experiment wird durch Neuroplex, ein Software-Paket aus RedShirtImaging, dass als Anwendung innerhalb der IDL-Plattform (Interactive Data Language) funktioniert und enthält mehrere Funktionen, die für Erfassung, Anzeige und Analyse der optischen Daten gesteuert. - Zusätzliche Kamera:
Als integraler Teil der Vorrichtung, einen Strahlteiler auf die Trinokulartubus des Mikroskops Relais ein Bild von der Vorbereitung auf einen zweiten, hochauflösenden CCD-Kamera an einen Frame-Grabber. Das Bild, das erworben und ist abgelegt unter Verwendung Global Lab Bild / 2 Software können auf dem Display des Sub-Millisekunden überlagert werden zeitaufgelöste optische Signale durch die NeuroCCD-SM-Kamera aufgenommen, um eine genaue Karte der räumlichen Herkunft der Erzeugung optisch erfasst Spannungssignale. In unserem Labor befindet sich die Frame-Grabber für diese Kamera in einem anderen Computer als den Verantwortlichen für die funktionelle Datenerfassung. Daher hat die Image-Datei von einem Computer zum anderen übertragen werden, und kleine Anpassungen in Größe und Position des Bildes in hoher Auflösung vor perfekte Registrierung der beiden Kameras erreicht wird benötigt.
Teil 7: Optische Experimente
- Vor jeder Aufnahme funktionaler, so erwerben wir das hochauflösende Schwarz-Weiß-Bild der Region, aus der wir planen, elektrische Aktivität durch optische Mittel aufnehmen (wie in 6.4 angegeben). Dieses Bild, wenn sie auf den Pixel-Karte der High-Speed-Kamera überlagert, hilft uns dabei, die Strukturen, die die Quelle der optischen Signale zu identifizieren.
- In den entsprechenden System-Konfiguration, Neuroplex (siehe 6.3) steuert auch den Auslöser, und löst die elektrische Stimulation. Da die High-Speed-Datenerfassung erfordert erhebliche Rechenleistung, ist es ratsam, wenn möglich, auf einem dedizierten Computer mit einer großen Menge an Arbeitsspeicher und eine Festplatte mit hoher Kapazität verwendet werden. Das ist jedoch nicht trivial. Unser eigenes System, z. B. bereits mehrere Jahre alt, beschäftigt Datenerfassungskarten, die zu groß, um in state-of-the-art Computer fit sind. Als Kompromiss hat man und widmet sich unser optisches System ein DELL Precision 390 mit einem 500-GB-Festplatte und 4 GB RAM ausgestattet. Dieser Computer erlaubt uns, unsere älteren, aber ausreichend, A / D und D / A-Karten und bietet dennoch genügend Leistung, um unsere Experimente ausführen.
- Sobald die Übernahme abgeschlossen ist, kann Neuroplex die Ergebnisse in mehrere, sich ergänzende Formate, von denen einige im Folgenden erläutert werden:
- Ein Bereich des Bildschirms aufgerufene Seite Display zeigt das rohe Bild des Präparats durch die 80X80 High-Speed-Kamera als Einzelbild festgehalten. Superposition auf diesem Pixel-Karte des hochauflösenden Bildes mit der zweiten Kamera (wie in 6,4 und 7,1) erworben verfeinert die Betreiber s Fähigkeit, Bereiche von Interesse zu identifizieren.
- Wenn Pixel dieser Seite anzuzeigen unter Maussteuerung ausgewählt sind, Neuroplex konvertiert automatisch die optischen Ausgänge in Spuren, die die Größe der optischen Veränderung durch die Pixel als Funktion der Zeit registriert zeigen. (ZB AF / F-Zeit). Der Bediener kann entscheiden, ob diese Spuren sollte die Ausgabe der einzelnen Pixel, oder besser gesagt, die Raum-Durchschnitt Ausgabe von mehreren Loci in einem bestimmten Bereich der Vorbereitung widerspiegeln.
- Die Daten können auch in Film-Format angezeigt werden.
Um sicherzustellen, dass alle Informationen, die in den einzelnen Versuchsreihen enthalten vollständig extrahiert werden, jedoch bevorzugen wir off-line Analyse der optischen Daten. Repräsentative Ergebnisse dieser Analyse sind vorhanden.
Teil 8: Wie die technische Qualität in einem optischen Experiment zu erreichen
The technischen Erfolg eines optischen Experiments gemessen wird, letztlich durch das Signal-Rausch-Verhältnis der Aufnahmen. Darüber hinaus ergibt sich ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis nicht von einer Epiphanie, sondern von einer Reise. Wie in einer Opernaufführung, ist das Endergebnis durch eine Vielzahl von Faktoren, die synergistisch zusammenwirken bestimmt. So eine technisch einwandfreie optische Experiment zu erreichen, ist es wichtig, zu suchen, unabhängig der optischen Vorrichtung und die Fähigkeiten, für jeden einzelnen Schritt des Protokolls erforderlich. Was folgt, ist eine Liste mit möglichen störungsfreien Gebieten, und einige Vorschläge zur Vermeidung von Problemen nicht immer 5 erwartet:
- Lärmquellen
Mechanische und optische Stabilität sind entscheidend bei der Aufzeichnung elektrischer Aktivität mit spannungsabhängigen Farbstoffen, da die relative Änderung (&Dgr; F / F), was eine physiologische Reaktionen relativ gering ist (<10% / 100 mV in den meisten der gut-Aufnahmen) und eine laute Spur immer Auguren ein schlechtes Ergebnis. Deshalb zur Optimierung des Signal-Rausch-Verhältnis, ist es unerlässlich, zu eliminieren oder zumindest zu minimieren, die Beiträge der beiden schlimmsten Übeltäter: a) mechanische Schwingungen, und b) Lichtquelle Fluktuation.- Mechanische Vibrationen werden durch eine Vielzahl von so unterschiedlichen Quellen wie Setup-Konfiguration, Aufbau von Stabilität, die Nähe von motorisierten Geräten, Luft-Strömungen, Schall, fließenden Bewegung, oder schwebende Partikel in der Badlösung erzeugt. Eine gute Vibrations-Isolations-System und akustischen Vorhang für extreme Fälle (siehe zB Beschreibung in 5.1), einen großen Unterschied machen und sind es wert, deren Kosten. Darüber hinaus sind common-sense Ansätze, wie zB Filtration von Lösungen im Experiment oder die Verwendung von magnetischen Basen für kleine, bewegliche Teile der Einrichtung verwendet werden, sehr effektiv.
- Lichtquellen sind am stabilsten bei quasi-maximale Intensität. Deshalb sollte ein Satz eine Strom-Grenzwert für die Stromversorgung, und, wenn nötig, reduzieren die Lichtintensität durch Einfügen neutral-density-Filter in den Lichtweg statt durch die Reduzierung der Spannung. Bogenlampen sind intrinsisch laut. Tungsten-Halogen-Glühlampen oder Leuchtdioden sind wesentlich stabiler und sollte die bevorzugte Wahl 6 sein.
- Alter der Tiere
Dissektionen sollte mit dem Darm von Jungtieren werden, weil, wie das Bindegewebe im Darm härtet mit dem Alter, es schwieriger wird, einzelne Gewebeschichten ohne großen Schaden zuzufügen auf die Neuronen der beiden Geflechte, deren zu-und abführenden Prozesse können separate Kreuz Schichtgrenzen und / oder Projekt ein gutes Stück entlang der Längsachse des Darms. Diese Empfehlung, die nicht berücksichtigt bei der Untersuchung intra-Ganglion Verbindungen werden können, ist von größter Bedeutung, wenn die experimentellen Ziel ist die Analyse der inter-ganglionären Schaltungen oder die Aktivierung von Reflexbahnen. - Dye Internalisierung
Es ist wichtig, auf ein so niedriges Farbstoffkonzentration wie möglich zu nutzen und unnötige Lichtexposition zu minimieren. Obwohl di-4-ANEPPDHQ hat sich als viel weniger phototoxische als andere Farbstoffe, wird es verinnerlicht, irgendwann, als die Gesundheit der Zubereitung verschlechtert. Dye Internalisierung nimmt das Signal-Rausch-Verhältnis durch die Erhöhung dramatisch Hintergrund Fluoreszenz 3. - Electrode Wartung
- Die Elektroden sollten sorgfältig und gründlich nach jedem Experiment gewaschen werden. Organische Ablagerungen an den Spitzen der Wolfram-Elektroden zu erhöhen Elektrodenwiderstand und verhindern Stimulation.
- Die Isolierung von kommerziell erhältlichen Wolfram-Elektrode ist sehr empfindlich und anfällig für Beschädigungen. Ein Leck in der Isolation wird Querstrom, Beeinträchtigung der Wirksamkeit der Stimulation und gefährden den Erfolg des Experiments.
- Perfusion Gefahren
Lassen Sie das Set-up unbeaufsichtigt, während der Perfusion auf. Wenn die in-flow-und Out-flow der Schlauchpumpe nicht richtig ausbalanciert, können zwei katastrophale Ereignisse statt:- Eine Flut kann zu einer irreversiblen Schädigung des Mikroskops.
- Das Präparat kann austrocknen während des Experiments.
- Software Ärger
Es ist wichtig, sich mit der Software, die Übernahme sowie die Analyse steuert vertraut zu machen. Schnelle Datenerfassung und / oder die Schaffung von sehr großen Dateien neigen dazu, das System an den Rand des Zusammenbruchs Laufwerk und Neuroplex, was ziemlich nachtragend ist, wird gnadenlos abstürzen, wenn ihre Randbedingungen eingehalten werden. Feinheiten innerhalb der Datensätze, leicht übersehen, wenn die Analyse auf begrenzte Bereiche von Interesse beschränkt ist, oft zeigen sich in Film zeigt der Daten.
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Discussion
Dieses Protokoll wurde mit zwei Toren im Hinterkopf geschrieben worden. Die erste besteht darin, andere Forscher zu überzeugen, dass, dank der vielen technologischen Fortschritte des letzten Jahrzehnts, optische Erfassung der elektrischen Aktivität mit spannungsabhängigen Farbstoffen hat sich zu einem der mächtigsten, zuverlässige und erschwingliche Methoden zur Untersuchung von intakten neuronalen Netzen, ja , könnte es leicht implementiert sogar in einem Labor mit bescheidenen Mitteln. Das zweite Ziel ist es, die enterale Nervensystem als eine einzigartige experimentelle Modell, in dem molekularen und zellulären Vorgänge mit dem elektrischen Verhalten der beiden neuronalen Geflechte und ihre biologische Ausgänge zu korrelieren zu fördern.
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Acknowledgments
Wir möchten DA Coulter (CHOP) für die Erlaubnis, seine 2-Photonen-Mikroskop verwenden, um die 2-Photonen-Bilder am Anfang des Videos gezeigt, und H. Takano für den Austausch mit uns sein technisches Know-how erwerben, zu danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M3769 | With Earle’s salts Without L-Glutamine, Phenol Red and Sodium Bicarbonate |
| Sylgard | Dow Corning | 184 silicone elastomer kit | |
| Insect pins used for dissection | F.S.T. | 26001-30 | |
| Dumont forceps | F.S.T. | 11203-23 or 11200-33 | |
| Moria MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | F.S.T. | 15371-92 | |
| Pins to hold the tissue during the experiment | Seirin Corp. | Seirin Spinex | |
| Collagenase VII | Sigma-Aldrich | C0773 | |
| Protease IX | Sigma-Aldrich | P6141 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10439-016 | |
| PenStrep | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| L-Glutamine 100X | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Nifedipine | Sigma-Aldrich | ||
| Di-4-ANEPPDHQ | Molecular Probes, Life Technologies | D36802 | |
| 4-Channel Stimulus Generator | Multi Channel System MCS GmbH | 2000 Series | |
| Peristaltic pump | Rainin | 2-channel Dinamax RP-1 | |
| High-speed camera | RedShirtImaging, LLC | NeuroCCD-SM | |
| 1:10 demagnifier / relay lens | Optem, Qioptiq Inc. | ||
| Upright microscope | Olympus Corporation | BX61TRF | |
| Gibraltar fixed stage with motorized X-Y translator | Gibraltar, Burleigh Instruments, EXFO, Quebec, Canada | PSSG--BX2 | |
| Linear matrix electrodes | FHC, Inc. | Custom made | |
| Active vibration-isolation table | Halcyonics,Inc., Menlo Park, CA | Micro 60 | |
| Ultra-low-ripple feedback stabilized power supply | Kepco, Flushing, NY | ATE 75-15M | |
| Heat filter | Schott AG | KG-1 | |
| High-Q interference filter | Chroma Inc. | HQ530/50 | |
| Dichroic mirror | Chroma Inc. | 565 nm (50% transmission) | |
| Long-pass filter | Chroma Inc. | HQ572LP | |
| Acoustic curtains | Acoustical Surfaces, Inc. | BSC-25 | |
| Neuroplex | RedShirtImaging, LLC | ||
| IDL | ITT Visual Information Solutions | ||
| High-resolution CCD camera, with its own camera controller | Hamamatsu Corp. | ||
| Frame-grabber for high-resolution camera | Data Translation | DT3120K-1 | |
| Imaging software for high-resolution camera | Data Translation | Global Lab Image/2 |
References
- Johnson, L. eonard R. in Physiology of the Gastrointestinal Tract, edited by Leonard R. , Raven Press. New York. 1-1 (1987).
- Obaid, A. L. Spatiotemporal patterns of activity in an intact mammalian network with single-cell resolution: optical studies of nicotinic activity in an enteric plexus. J Neurosci. 19 (8), 3073-3073 (1999).
- Obaid, A. L., Loew, L. M., Wuskell, J. P., Salzberg, B. M. Novel naphthylstyryl-pyridinium potentiometric dyes offer advantages for neural network analysis. J. Neurosci. Methods. 134 (2), 179-179 (2004).
- Hirst, G. D., McKirdy, H. C. Synaptic potentials recorded from neurones of the submucous plexus of guinea-pig small intestine. J Physiol (Lond). 249 (2), 369-369 (1975).
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- Salzberg, B. M. An ultra-stable non-coherent light source for optical measurements in neuroscience and cell physiology. Journal of Neuroscience Methods. 141, 165-16 (2005).
- Obaid, A. L., Nelson, M. E., Lindstrom, J., Salzberg, B. M. Optical studies of nicotinic acetylcholine receptor subtypes in the guinea-pig enteric nervous system. J Exp Biol. 208 (Pt 15), 2981-2981 (2005).
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- Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system. Nature. 246 (5434), 508-508 (1973).
