Summary
Un protocole détaillé est décrit pour l'imagerie en temps réel la formation de complexes de réparation de l'ADN
Abstract
Les deux procaryotes et les eucaryotes répondent aux dommages à l'ADN à travers un ensemble complexe de changements physiologiques. Altérations de l'expression génique, la redistribution des protéines existantes, et l'assemblage des complexes protéiques nouvelle peut être stimulée par une variété de lésions de l'ADN et dépareillés paires de bases d'ADN. La microscopie à fluorescence a été utilisé comme un puissant outil expérimental pour la visualisation et la quantification de ces réponses et autres lésions de l'ADN et à surveiller l'état de réplication de l'ADN au sein de l'architecture complexe subcellulaire d'une cellule vivante. Fusions traductionnelles entre les protéines rapporteur fluorescent et des composants de la réplication de l'ADN et les machines de réparation ont été utilisés pour déterminer les indices que les protéines cibles réparation de l'ADN de leurs lésions apparentées
Protocol
Cultures en croissance de cellules pour la microscopie
1. Un ou deux jours avant l'imagerie, de préparer le B. subtilis souche contenant la protéine de fusion traductionnelle vous souhaitez visualiser. Tours de première instance de 1A et 1B étapes seront nécessaires pour déterminer quelle condition la croissance fournit les meilleures images de vos contraintes. Dans la plupart des cas, les cellules doivent être imagés pendant la phase de croissance exponentielle.
- Pour certaines B. souches subtilis (en particulier, les souches qui poussent mal en raison de l'intégration de la fusion traductionnelle entre le gène d'intérêt et de la GFP à son locus endogène), la croissance initiale de deux jours avant l'imagerie est nécessaire pour des images de haute qualité. Le premier jour, série B. subtilis souche à imager sur gélose LB avec antibiotique sélectif (s) et incuber une nuit à 30 ° C. Le deuxième jour, inoculer 100 pl de solution saline à 0,85% avec une seule colonie et de réaliser trois de 10 dilutions successives sur les plaques d'agar LB (avec des antibiotiques sélectifs), le placage 100 ul de chaque dilution, suivie par une nuit d'incubation à 30 ° C. Le troisième jour, sélectionnez la plaque de dilution avec une croissance confluente lumière des cellules. Lumière croissance confluente sur une plaque fournira le milieu de croissance avec une bonne santé, l'inoculum de départ en croissance exponentielle pour éventuellement donner des résultats excellents imagerie (voir étape 4). Cette étape est particulièrement utile pour l'imagerie de membrane de haute qualité avec la tache FM4-64.
- B. Autres souches subtilis peut simplement être appliquée à un milieu LB gélose sélective pour les colonies isolées avec un bâton stériles le jour précédant l'imagerie et incuber une nuit à 30 ° C. Le jour suivant, les cellules sur cette plaque sera suffisant pour utiliser comme inoculum pour l'imagerie (voir étape 4).
REMARQUE: Pour B. subtilis, cultures de la nuit dans un milieu liquide ne sont pas appropriées en raison d'une combinaison de la formation de spores et les réponses de quorum, ce qui provoquera une longue période de croissance une phase de latence.
2. Le matin de l'imagerie, placer 10 ml de S7 50 moyennes 1-3 dans un flacon Erlenmeyer de 125 ml stérile.
3. Resuspendre les cellules dans un maximum de 2 mL de S7 50 moyennes de la plaque de gélose LB avec des colonies isolées ou les cellules confluentes de lumière pour obtenir un inoculum.
4. Ajouter suffisamment S7 50 moyen de cellules d'inoculum à l'erlenmeyer contenant 10 ml S7 50 moyennes pour une culture avec une densité optique initiale mesurée à 600 nm (DO 600) de ~ 0,08 à 0,1. À cette étape, il est important d'avoir au moins un air de 10 fois le ratio moyen. Ainsi, nous utilisons 10 à 12,5 ml de milieu inoculé dans un flacon Erlenmeyer de 125 ml.
5. Croître chaque culture à 30 ° C jusqu'à ce que la culture atteint une DO 600 ~ de 0,5 à 0,8. Bains à agitation sont préférés aux révolutions par minute à partir 150-200. Cultures a contesté avec des agents endommageant l'ADN induisant ou de l'asymétrie doit être à une phase de croissance exponentielle au début OD 600 de telle sorte que les cellules vont atteindre l'objectif OD 600 avec la période de croissance supplémentaire qui est requis pour le traitement (voir tableau 1)
Par exemple, la 2-aminopurine nécessite une heure de traitement, et donc une culture traitée avec la 2-aminopurine devrait être à une DO 600 ~ 0.3 à 0.4, telles que l'heure l'un des traitements / résultats de croissance dans une DO 600 ~ 0.5-0.8, par lequel les cellules sont prêtes pour l'imagerie.
Préparation des échantillons
1. Pipeter 300 ul de cellules cultivées dans un tube de 1,5 ml.
2. Si l'imagerie des membranes cellulaires est souhaitée, ajoutez la dilution de 1:1000 FM4-64 membrane tache (Invitrogen) pour chaque échantillon d'une solution à 1 mg / ml. Un titrage de FM4-64 peut être nécessaire pour atteindre le signal de fluorescence désirée. Une gamme de titrage typique est 1:100, 1:1000 et 1:10000.
3. Laisser les échantillons reposer à température ambiante pendant jusqu'à dix minutes ou alors la lame est en préparation avec 1% d'agarose en 1X moyennes Spizizens comme décrit ci-dessous (voir l'étape 1 de "préparation des lames»).
4. Si la concentration de cellules est nécessaire, nous préférons les cellules de filtrage utilisant un filtre de 0,2 um avec un appareil à vide. Les cellules peuvent ensuite être lavés en douceur de la surface du filtre avec du PBS, un autre tampon approprié ou moyenne avant la visualisation.
Préparation des lames
1. Préparer agarose à 1% avec 1X Spizizens.
Ajouter 5 ml de bouillon de Spizizens 10X à 45 ml ddH2O avec 0,5 g d'agarose, et micro-ondes pour faire fondre. Chaud agarose fondu est difficile de pipette, et solidifié agarose n'entrera pas dans la pointe de la pipette. L'agarose doit être équilibrée dans un bain d'eau à une température de 55-65 ° C ~ pour elle d'entrer dans la pointe de la pipette sans se solidifier dans le pointe.
2. Tirage 20 ul de Spizizens avec 1% d'agarose fondu dans la pointe de la pipette. Pipeter une seule goutte (environ 1-2 pi) de la solution d'agarose dans chaque diapositive ainsi (nous utilisons 15 et diapositives, voir tableau 2) pour former superficielle coussinets d'agarose. L'agarose se solidifie immédiatement. Les diapositives doivent également être faite immédiatement avant l'application de ces cellules. Si les plaquettes sont agarose laissé à température ambiante seuls, ils peuvent se déshydrater en quelques minutes et devenir inutilisable.
Coussinets agarose doit être centré et remplir chaque bien, mais avoir une hauteur minimale pour éviter de perturber la lamelle, si les gouttelettes sont trop élevés (en bulle) ou si l'échantillon se propage au-delà des limites bien, passez simplement le bien nettoyer avec un Kimwipe et appliquer une nouvelle agarose pad.
3. Appliquer l'ensemble échantillon de 300 ul (voir étape 6) à la diapositive, distribué sur le dessus de chaque pad agarose. Cette quantité de cellules devrait être suffisante pour couvrir chaque puits sur la diapositive.
4. Laisser la lame avec des cellules chargées de s'asseoir à la température ambiante (23 ° C) pendant environ dix minutes. Cette étape va permettre aux cellules de s'installer sur le coussin d'agarose devenir immobiles et prêts pour l'imagerie. Pour des besoins spécialisés de cette température peut être nécessaire de changer, par exemple, lors de la réalisation des expériences qui nécessitent un changement de température 4.
5. Aspirer l'écart moyen supérieur de chaque puits sans enlever les plaquettes elles-mêmes.
6. Appliquer la lamelle sur la lame, en appuyant fermement et uniformément, mais doucement, à travers la zone de la diapositive. Assurez-vous que la lamelle est contre la lame et que la lamelle n'est pas élevée au-dessus de la diapositive.
Visualisation des cellules
1. Beaucoup de différents microscopes à fluorescence va bien travailler. Il est essentiel d'avoir une lentille d'huile d'immersion 100X. Le laboratoire utilise Simmons:
- Olympus BX61 microscope équipé d'1,45 NA TIRFM huile lentille 100X objectif à immersion
- Hamamatsu ORCAR 2 CCD refroidi appareil
- Lumen métallique à l'arc 200 (Avant) source de lumière.
- Pour la détection de la GFP (ITCF), filtre d'excitation et d'émission de 460 à 500 510 à 560
- Pour la détection de FM4-64 (TRITC), filtre d'excitation et d'émission de 510 à 560 572 à 648.
- Les images ont été capturées à l'aide SlideBook 4,2 (figure 1)
2. Apportez les cellules en utilisant concentrer la lumière blanche.
3. Capturer l'image en utilisant des filtres appropriés pour chaque fluorophore.
Les résultats représentatifs
Des images représentatives sont affichés (figure 1). GFP foyers doivent être bien définis, tandis que FM4-64 coloration doit être claire et lumineuse 4-7. Images GFP ou membrane peut être pseudo-couleur avec n'importe quelle couleur, afin de permettre la meilleure qualité d'image qui sera présentée sans perdre aucune donnée.
Figure 1: les images représentant la GFP de B. subtilis protéines de fusion traductionnelle. protéines GFP sont indiquées en vert, tandis coloration FM4-64 membrane est représentée en rouge. La barre d'échelle blanche indique 3 microns (A) MutS-GFP [génotype pertinents: mutS - gfp (CPS), Amye:: CCPFP mutL (chat)]. En présence de 600 ug / ml 2-aminopurine et 1 mM d'IPTG. FM4-64 du signal n'est pas présentée de manière à montrer plus clairement les foyers MutS-GFP (B) MutL-GFP [génotype pertinents: mutL:: mutL-GFP (SPC)].. En présence du 2-aminopurine (C) DNAX-GFP [génotype pertinents: DNAX:: DNAX-GFP (SPC)]. (D) RecA-GFP [génotype pertinents: recA:: recA-GFP (SPC)] en présence de 20 ng / ml de mitomycine C (E) tagC-GFP [génotype pertinents: tagC:: tagC-GFP (CPS) ] en présence de 1 pg / ml de mitomycine C.
| Traitement / concentration ou la quantité | Fonction | Temps d'incubation |
| La mitomycine C (MMC) [20 à 150 ng / ml] | Agent alkylant l'ADN | 1 heure |
| 2-aminopurine (2-AP) [600 ug / ml] | induisant discordance | 1 heure |
| L'hydroxyurée (HU) | épuise les dNTP | 3 heures |
| la lumière ultraviolette (UV) 20 J/m2 | Thymine-thymine dimères et 6-4 photoproduits | varie selon la source, habituellement 20 secondes |
| grays (rayonnements ionisants) 5 à 100 Gy | Cassures double brin, cassures simple brin et les sites de dégâts de base | varie selon la source |
| Nom du réactif | Société | Numéro de catalogue | Commentaires (optionnel) |
| Multitest diapositives, 15 puits | MP Biomédical | 6041505E | |
| Verre Couverture Microscope | Fisher | 12 à 544-B | |
| Agarose | Fisher | BP160-500 | |
| Mitomycine C | Sigma | M0503-2MG | mutagène, porter des gants |
| 2-aminopurine | Sigma | A3509-250MG | des gants |
| L'hydroxyurée | Sigma | H8627-25G | des gants |
| FM4-64 | Invitrogen | T13320 | sensible à la lumière |
Tableau 2. Liste des réactifs et équipements spécifiques:
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Discussion
Essais et erreurs sont nécessaires pour trouver des conditions d'exposition pour des images de haute qualité pour chaque souche; nous trouvons que 1 milliseconde est approprié pour des images en lumière blanche, tandis que des expositions de 100 à 2000 ms sont appropriés pour la GFP (FITC) et FM4-64 (TRITC ) des images. Le temps d'exposition varie en fonction de l'équipement d'imagerie utilisée. Nous recommandons l'utilisation d'une souche par lame de microscope 15 puits pour les plus simples d'imagerie, comme la qualité de pad et la diffusion des cellules de la frontière pad pourrait compliquer différenciation des souches si des souches multiples sont présents sur la même lame. La qualité d'image dépend directement de la qualité de la plaquette d'agarose où les bactéries sont au repos. Les images de haute qualité seront capturées à partir coussinets d'agarose où les bactéries sont côte à côte. Pads qui causent les cellules bactériennes à s'agglutiner, ce qui empêche une monocouche, va produire des images pauvres. Pads qui sont trop épais va produire un signal de fond élevé fluorescentes, tandis coussinets qui sont déshydratés ne permettra pas aux cellules de se reposer correctement. Ces défauts d'agarose pad entraîne généralement une qualité d'image très pauvre. Si un bien est la production d'images pauvres, tout simplement passer à la prochaine aussi. Il est idéal pour capturer entre 50 et 200 cellules par l'image. La microscopie à fluorescence a fourni une mine d'informations détaillant les indices cellulaires qui dirigent le montage de réparation de l'ADN et les protéines de réplication dans des foyers in vivo. Avec la pratique, cette technique peut être appliquée avec succès à une variété de complexes protéiques dans de nombreuses espèces bactériennes.
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Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier les Drs. Philina S. Lee et Alan D. Grossman pour un premier entraînement LAS en microscopie à fluorescence. Les auteurs remercient également les Drs. Mélanie Berkmen et Hajime Kobayashi de l'aide et des conseils pour l'imagerie. Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage du Collège de Littérature, Sciences & Arts et du ministère de la biologie moléculaire, cellulaire et du développement à l'Université du Michigan.
Materials
| Specific solution recipes1: | |||
| 10x S750 salts 0.5 M MOPS 100 mM Ammonium Sulfate 50 mM Potassium Phosphate Monobasic Filter sterilize, and wrap S750 media in foil prior to storage |
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| 100x Metals 0.2 M MgCl2 70 mM CaCl2 5 mM MnCl2 0.1 mM ZnCl2 100 μg/mL Thiamine HCl 2 mM HCl 0.5 mM FeCl3* dH2O to final volume *FeCl3 should be added last, to prevent precipitation. After filter sterilization, wrap 100x Metal solution in foil. |
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| S750 media 1x S750 salts 1x Metal 1% Glucose 0.1% Glutamate 40 μg/mL Tryptophan 40 μg/mL Phenylalanine distilled H2O to final volume |
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| 10x Spizizens (grams/L) 151.4 mM Ammonium Sulfate (20g/L) 803.8 mM Potassium Phosphate Monobasic (140g/L) 440.9 mM Potassium Phosphate Dibasic (60g/L) 34.0 mM Sodium Citrate (10g/L) 16.6 mM MgSO4 (2g/L) dH2O to final volume Filter sterilize |
References
- Hardwood, C. R., Cutting, S. M. Molecular Biological Methods for Bacillus. , John Wiley and Sons. Chichester. (1990).
- Berkmen, M. B., Grossman, A. D. Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle. Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).
- Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis. Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).
- Simmons, L. A. Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction. J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).
- Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. Visualization of mismatch repair in bacterial cells. Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).
