Summary
Подробный протокол описан для визуализации реального времени формирования комплексов репарации ДНК в
Abstract
Оба прокариоты и эукариоты ответ на повреждение ДНК через сложный набор физиологических изменений. Изменения в экспрессии генов, перераспределения существующих белков и сборку новых белковых комплексов можно стимулировать с помощью различных повреждений ДНК и несовпадающих пар оснований ДНК. Люминесцентной микроскопии был использован в качестве мощного экспериментального инструмент для визуализации и количественной оценки этих и других ответов на повреждения ДНК и контролировать состояние репликации ДНК в комплексе архитектуры субклеточных живой клетке. Поступательное слияния между флуоресцентных белков репортер и компоненты репликации ДНК и ремонт техники были использованы для определения сигналов, предназначенных для восстановления ДНК белков на их родственные поражения
Protocol
Рост культур клеток для микроскопии
1. Один или два дня до визуализации, подготовки B. Сенная штамм содержащие поступательного белка слияния вы хотите визуализировать. Судебная раундов шаги 1А и 1В будет необходимо определить, какой рост условие обеспечивает лучшие изображения вашего напряжения. В большинстве случаев, камеры должны быть отображены в экспоненциальной фазе роста.
- Для некоторых B. Сенная штаммов (в частности, штаммы, которые растут плохо из-за интеграции поступательного слияние гена GFP и на ее эндогенного локуса), начальный рост за два дня до визуализации необходима для изображения высокого качества. В первый день, полоса B. Сенная напрягаться, чтобы быть отображены на LB агар с селективной антибиотика (ов) и инкубировать в течение ночи при 30 ° C. На второй день, привить 100 мкл 0,85% физиологического раствора с одной колонии и выполнять три 10-кратный серийных разведений на пластинах LB агар (с выборочным антибиотики), покрытие 100 мкл каждого разведения, после инкубации в течение ночи при температуре 30 ° C. На третий день, выберите разбавления пластины светом сплошной рост клеток. Свет сплошной рост на тарелку обеспечит рост среде с здоровыми, экспоненциально растущей стартер посевной потенциально доходность отличные результаты томографии (см. шаг 4). Этот шаг является особенно полезным для высокого качества снимков мембраны с пятном FM4-64.
- Другие Б. Сенная штаммы могут просто быть применены к селективной среде агара LB для одной колонии с стерильных палку день до визуализации и инкубировать в течение ночи при 30 ° C. На следующий день, клеток на этой пластинке будет достаточно для использования в качестве посевного для работы с изображениями (см. шаг 4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для Б. Сенная, ночевка культур в жидкой среде не подходят из-за сочетания образования спор и кворум ответов, которые вызовут длительный период лаг-фазы роста 1.
2. В первой половине дня с изображениями, место 10 мл 50 S7 1-3 среду в 125 мл стерильной колбе Эрленмейера.
3. Ресуспендируют клетки до 2 мл 50 S7 среду из пластин LB агар с одной колонии или свет сливной клетки для получения посевной.
4. Добавьте достаточно S7 50 средних ячейки посевной в колбу, содержащую 10 мл 50 S7 среда для культуры с начальной оптической плотности измеряется при 600 нм (ОП 600) от ~ 0,08 до 0,1. На этом этапе важно иметь как минимум 10-кратное воздух средней кратности. Таким образом, мы используем 10 до 12,5 мл прививку среды в 125 мл колбе Эрленмейера.
5. Расти каждой культуры при 30 ° С до культуры достигает OD 600 ~ 0,5-0,8. Shaking водяные бани являются предпочтительными с оборотов в минуту от 150-200. Культуры вызов с агентами ДНК повреждения или несоответствия вызывающие должны быть на ранней экспоненциальной фазе роста OD 600, что клетки достигнет целевого OD 600 с дополнительным периодом роста, который требуется для лечения (см. Таблицу 1)
Например, 2-аминопурин требуется один час лечения, и, следовательно, культура рассматривается с 2-аминопурин должна быть диаметром 600 ~ 0,3-0,4, например, что один час лечения / рост результатов в OD 600 ~ 0.5-0.8, которой клетки готовы для работы с изображениями.
Подготовка образцов
1. Внесите 300 мкл культивируемых клеток в 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
2. Если изображения клеточных мембран требуется, добавьте 1:1000 разбавления FM4-64 мембраны пятна (Invitrogen) для каждого образца от 1 мг / мл маточного раствора. Титрования FM4-64 могут потребоваться для достижения желаемого сигнала флуоресценции. Типичный диапазон титрования составляет 1:100, 1:1000 и 1:10000.
3. Разрешить образцы сидеть при комнатной температуре в течение десяти минут или во время слайд готовится с 1% агарозы в 1X среду Spizizens, как описано ниже (см. шаг 1 "слайд подготовки").
4. Если концентрация клеток не требуется, мы предпочитаем фильтрация клеток с использованием 0,2 мкм фильтр с вакуумным аппаратом. Клетки могут быть затем аккуратно промыть водой с поверхности фильтра с PBS, другой соответствующий буфер или среднего до визуализации.
Подготовка слайдов
1. Подготовка 1% агарозном с 1X Spizizens.
Добавьте 5 мл 10X фондовом Spizizens до 45 мл ddH2O наряду с 0,5 г агарозы, и микроволновая печь растопить. Горячий расплавленный агарозном трудно пипетки и затвердевшей агарозы не войдет пипетки. Агарозном должны быть доведены в водяной бане до температуры ~ 55-65 ° C для его вступления пипетки без затвердевания в течение наконечник.
2. Ничья 20 мкл Spizizens с 1% агарозы в расплавленный кончика пипетки. Внесите ни капли (примерно 1-2 мкл) раствора агарозы в каждом слайде хорошо (мы используем 15-и слайды, см. таблицу 2) в форме мелкой колодки агарозы. Агарозном укрепит немедленно. Слайды должны быть сделаны непосредственно перед применением клеток. Если агарозном колодки оставляют при комнатной температуре в одиночку, они могут обезвоживают в течение нескольких минут и становятся непригодными для использования.
Агарозном подушки должны быть в центре и заполнить каждую лунку, но имеют минимальную высоту, чтобы избежать нарушения покровное, если капли слишком высоко (пузырь-подобные), или если образец распространяется за пределы и границы, просто проведите хорошо чистить Kimwipe и применить новые агарозном площадку.
3. Применить все 300 мкл образца (см. шаг 6) на слайд, распространяемую на верхней части каждой площадки агарозы. Такое количество клеток должно быть достаточным для покрытия каждой скважины на слайде.
4. Разрешить слайд загружается с клетками сидеть при комнатной температуре (23 ° С) в течение примерно десяти минут. Этот шаг позволит клеткам оседать на площадке агарозном становятся неподвижными и готов для работы с изображениями. Для нужд специализированных этой температуре возможно, должны быть изменены, например, при проведении экспериментов, требующих температурный сдвиг 4.
5. Аспирируйте излишки среды из каждой лунки, не снимая колодки сами.
6. Применить покровное к слайду, нажимая твердо и равномерно, но мягко, по области слайда. Убедитесь, что крышка скольжения против слайдов и что покровное стекло не поднимается выше слайде.
Визуализация клеток
1. Много различных флуоресцентных микроскопов будет хорошо работать. Очень важно, чтобы объектив 100X иммерсионного масла. Симмонс Лаборатория использует:
- Olympus BX61 Микроскоп оснащен 1,45 NA TIRFM 100X нефти объектив погружения
- Hamamatsu ORCAR 2 ПЗС-камеры охлаждения
- Lumen 200 дуги металла (До) источника света.
- Для обнаружения GFP (FITC), фильтр возбуждения и испускания 460-500 510-560
- Для обнаружения FM4-64 (TRITC), фильтров возбуждения и испускания 510-560 572-648.
- Изображения были получены с помощью SlideBook 4,2 (рис. 1)
2. Принесите клетки в центре внимания с использованием белого света.
3. Захват изображения с помощью соответствующих фильтров для каждого флуорофора.
Представитель Результаты
Представитель изображений показаны (рис. 1). GFP очаги должны быть четко определены, в то время FM4-64 окрашивания должен быть ярким и ясным 4-7. GFP или мембраны изображения могут быть псевдо цвета с любым цветом, чтобы обеспечить высочайшее качество изображения, которое будет представлено без потери данных.
Рисунок 1: представитель изображений GFP Б. Сенная поступательного слитых белков. GFP белка отображаются зеленым цветом, в то время FM4-64 мембраны окрашивания отображается красным цветом. Белая полоса масштаба указывает 3 мкм () MutS-GFP [соответствующего генотипа: mutS - GFP (SPC), amyE:: Pspac mutL (кот)]. В присутствии 600 мкг / мл, 2-аминопурин и 1 мМ IPTG. FM4-64 сигнал не представлены, с тем чтобы более четко показать MutS-GFP очагов (B) MutL-GFP [соответствующего генотипа: mutL:: mutL-GFP (SPC)].. В присутствии 2-аминопурин (С) DnaX-GFP [соответствующего генотипа: dnaX:: dnaX-GFP (SPC)]. (D) RecA-GFP [соответствующего генотипа: гесА:: гее-GFP (SPC)] в присутствии 20 нг / мл митомицин С (Е) TagC-GFP [соответствующего генотипа: tagC:: tagC-GFP (SPC) ] в присутствии 1 мкг / мл митомицин С.
| Лечение / концентрация или количество | Функция | Время инкубации |
| Митомицин С (MMC) [20 до 150 нг / мл] | ДНК алкилирующим агентом | 1 час |
| 2-аминопурин (2-AP) [600 мкг / мл] | Несоответствие индуцирующих | 1 час |
| Гидроксимочевина (HU) | истощает дНТФ | 3 часа |
| ультрафиолетовый свет (УФ) 20 Дж/м2 | Тимин-тимин димеров и 6-4 фотопродуктов | варьируется в зависимости от источника, обычно 20 секунд |
| серый (ионизирующее излучение) от 5 до 100 Гр | Дважды разрывов ДНК, разрывами одноцепочечной и сайтов базовый урон | варьируется в зависимости от источника |
| Название реагента | Компания | Номер в каталоге | Комментарии (необязательно) |
| MultiTest слайд, 15-а | Депутат Biomedicals | 6041505E | |
| Стекло микроскопа Обложка | Рыболов | 12-544-B | |
| Агароза | Рыболов | BP160-500 | |
| Митомицин C | Сигма | M0503-2 мг | мутаген, наденьте перчатки |
| 2-аминопурин | Сигма | A3509-250мг | перчатки |
| Гидроксимочевина | Сигма | H8627-25G | перчатки |
| FM4-64 | Invitrogen | T13320 | светочувствительный |
Таблица 2. Список специфических реагентов и оборудования:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Методом проб и ошибок требуется найти воздействия условий для высокого качества изображения для каждого штамма, мы находим, что 1 миллисекунду подходит для белых изображений света, в то время как воздействие от 100 до 2000 мс подходят для GFP (FITC) и FM4-64 (TRITC ) изображения. Экспозиция будет меняться в зависимости от изображения используемого оборудования. Мы рекомендуем использовать один штамм в 15-и стекло микроскопа для простейшей обработки изображений, как качество площадку и распространению клеток от границы площадки могут осложнить штамм дифференциации если несколько штаммов присутствуют на одном слайде. Качество изображения напрямую зависит от качества площадки агарозы, где бактерии отдыхают. Изображение высочайшего качества будут захвачены из агарозы колодки, где бактерии бок о бок. Колодки, которые вызывают бактериальные клетки в комок, предотвращая монослоя, будет производить бедных изображений. Колодки, которые являются слишком толстыми будет производить высокий фон флуоресцентный сигнал, в то время прокладки, которые обезвожены не позволит клеткам, чтобы отдохнуть должным образом. Эти агарозном площадку дефекты, как правило, приводит к очень плохим качеством изображения. Если также производит бедных изображения, просто перейти к следующему хорошо. Он идеально подходит для захвата от 50 до 200 клеток на изображении. Люминесцентной микроскопии предоставил обширную информацию подробно сотовые сигналы, которые прямой сборки репарации ДНК и белков в репликации очагов в естественных условиях. С практикой, эта методика может с успехом применяться для различных белковых комплексов во многих видов бактерий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра. Philina С. Ли и Алан Д. Гроссман для Первоначально обучение ЛАГ в флуоресцентной микроскопии. Авторы также благодарят доктора. Мелани Беркмен и Hajime Кобаяси за помощь и советы для работы с изображениями. Эта работа была поддержана запуска средства из Колледжа литературы, науки и искусства и от Департамента молекулярном, клеточном и биологии развития в Университете штата Мичиган.
Materials
| Specific solution recipes1: | |||
| 10x S750 salts 0.5 M MOPS 100 mM Ammonium Sulfate 50 mM Potassium Phosphate Monobasic Filter sterilize, and wrap S750 media in foil prior to storage |
|||
| 100x Metals 0.2 M MgCl2 70 mM CaCl2 5 mM MnCl2 0.1 mM ZnCl2 100 μg/mL Thiamine HCl 2 mM HCl 0.5 mM FeCl3* dH2O to final volume *FeCl3 should be added last, to prevent precipitation. After filter sterilization, wrap 100x Metal solution in foil. |
|||
| S750 media 1x S750 salts 1x Metal 1% Glucose 0.1% Glutamate 40 μg/mL Tryptophan 40 μg/mL Phenylalanine distilled H2O to final volume |
|||
| 10x Spizizens (grams/L) 151.4 mM Ammonium Sulfate (20g/L) 803.8 mM Potassium Phosphate Monobasic (140g/L) 440.9 mM Potassium Phosphate Dibasic (60g/L) 34.0 mM Sodium Citrate (10g/L) 16.6 mM MgSO4 (2g/L) dH2O to final volume Filter sterilize |
References
- Hardwood, C. R., Cutting, S. M. Molecular Biological Methods for Bacillus. , John Wiley and Sons. Chichester. (1990).
- Berkmen, M. B., Grossman, A. D. Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle. Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).
- Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis. Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).
- Simmons, L. A. Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction. J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).
- Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. Visualization of mismatch repair in bacterial cells. Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).
