Summary
詳細なプロトコルは、イメージングのためのDNA修復複合体のリアルタイムの形成を説明しています
Abstract
原核生物と真核生物の両方の生理的変化の複雑なセットを介してDNA損傷に応答する。遺伝子発現、既存の蛋白質の再分配、及び新たなタンパク質複合体のアセンブリの変化は、DNAの損傷とミスマッチDNAの塩基対の種々の方法によって刺激することができる。蛍光顕微鏡は、DNA損傷にと生きている細胞の複雑な細胞内のアーキテクチャの中でDNAの複製の状態を監視するために、これらおよび他の応答を可視化し定量化するための強力な実験ツールとして用いられている。蛍光レポータータンパク質とDNA複製と修復機構のコンポーネント間の翻訳融合は、手がかりを決定するために使用されているその同族病変の標的DNA修復タンパク質
Protocol
顕微鏡の細胞の成長文化
1。一または二日には、イメージングの前に、Bを用意する枯草菌では、可視化したい翻訳融合タンパク質を含む菌株。ステップ1Aおよび1Bの試験のラウンドは、成長条件があなたの株の最高の画像を提供しているかを判断するために必要となります。ほとんどの場合、細胞は対数増殖期の間に撮像することがあります。
- いくつかのBの枯草菌の菌株（特に、不完全にその内因性遺伝子座での関心とGFPの遺伝子との間の翻訳融合の統合による成長株）、画像への2日前の初期成長は、高品質の画像のために必要です。初日に、ストリークB.枯草菌は、抗生物質（複数可）を含むLB寒天培地上に結像されるひずみと30℃で一晩インキュベート二日目に、単一のコロニーを0.85％生理食塩水100μlを接種し、30℃で一晩インキュベートした各希釈液100μLをめっきLB寒天プレート上で3つの10倍段階希釈液（選択的な抗生物質）、、℃を実行三日目に、細胞の光密集成長による希釈プレートを選択します。板上に光密集成長が潜在的に（ステップ4を参照）、優れた画像処理結果を得るために、健康、指数関数的に成長しているスターター接種した培地を提供します。このステップでは、染色FM4 - 64で最高品質の膜のイメージングのために特に有用である。
- 他のB.枯草菌の菌株は、単に無菌スティックイメージングの前に一日で、単一のコロニーのための選択LB寒天培地に塗布され、30℃で一晩インキュベートすること翌日、このプレート上の細胞は、（ステップ4を参照）イメージングのための接種物として使用することは十分になります。
注：Bの枯草菌は 、液体培地で一晩培養では起因する遅滞期の成長 1 の長期間の原因となる胞子形成とクォーラムの応答、の組み合わせに適しているわけではありません 。
2。イメージング、125mLの滅菌三角フラスコにS7 50 1から3培地の代わりに10mLの日の朝。
3。接種を得るために、単一コロニーまたは光コンフルエントの細胞を含むLB寒天プレートからS7 50培地2 mLまでの細胞を再懸濁します。
4。 0.1〜〜0.08の600nmで測定された初期の光学密度（OD 600）との文化のための10mLのS7 50培地を入れた三角フラスコに十分なS7 50中期細胞接種を追加。このステップでは、それは少なくとも10倍空気媒質の比にしておくことが重要です。従って、我々は125 mLの三角フラスコに接種した培地を10〜12.5mlのを使用してください。
5。文化は、OD 600を 〜0.5から0.8に達するまで30℃でそれぞれの文化を育てる。揺れ水浴を150から200までから毎分回転数で好ましい。 DNA損傷または不整合誘導剤で攻撃の文化は（表1参照）初期の指数増殖期細胞は、治療のために必要とされる成長の追加の期間でOD 600のターゲットに到達するようにOD 600になっているはず
例えば、2 -アミノプリンは、治療の一時間を必要とするため、2 -アミノプリンで治療された文化は、OD 600になっているはず〜0.3から0.4まで、このようなOD 600の治療/成長の結果の一時間いる〜0.5から0.8、それによって細胞がイメージングのための準備が整いました。
サンプル準備
1。ピペット1.5 mlマイクロ遠心チューブに培養細胞を300μl。
2。細胞膜のイメージングが必要な場合は、1 mg / mLの原液から各サンプルに汚れFM4 - 64膜（Invitrogen社）の1:1000希釈を追加。 FM4 - 64の滴定は、所望の蛍光信号を達成するために必要な場合があります。典型的な滴定の範囲は1:100、1:1000、および1:10,000です。
3。サンプルは最大10分間、室温で座ることを許可またはスライドは以下に述べるように培地1X Spizizensの1％アガロース（"スライドの準備"のステップ1を参照）を用いて調製されている間。
4。細胞の濃度が必要な場合、我々は、真空装置と、0.2μmフィルターを用いてフィルタリングセルを好む。その後、細胞を穏やかにPBS、別の適切な緩衝液または可視化に先立って培地とフィルターの表面から洗浄することができます。
スライドの準備
1。 1X Spizizensを1％アガロースを準備します。
5 0.5 Gアガロースと共に10X SpizizensストックのmLの45ミリリットルddH2Oに、そして溶融にマイクロ波を追加。ホット溶融アガロースは、ピペッティングすることは困難であり、アガロースがピペットの先端を入力しません固化。アガロースが〜55から65までの温度° Cまで、それは内に固化せずにピペットチップを入力するための水浴中で平衡化してください先端。
2。 1％はピペットの先端にアガロースを融解とSpizizensの20μlを描く。ピペット浅いアガロースパッドを形成するために、各スライドにアガロース溶液の一滴（約1〜2μL）も（我々は15ウェルスライドを使用して、表2を参照）。アガロースは、すぐに固化される。スライドは、細胞のアプリケーションの直前に行う必要があります。アガロースパッドを単独で室温で放置されている場合、それらは数分で脱水し、使用できなくなることがあります。
アガロースパッドが中央にしても、それぞれを埋めるがカバースリップの中断を回避するために最小の高さを持っている必要があります。、液滴が高すぎる（バブル的）またはサンプルはうまく境界を越えて広がる場合キムワイプでよくきれいなだけでスワイプして、適用新しいアガロースパッド。
3。各アガロースパッドの上に分散し、スライド全体を300μlのサンプルを（ステップ6を参照）を適用します。細胞のこの量は、スライド上の各ウェルをカバーする十分なはずです。
4。約10分間（23℃）、室温で座っているセルを搭載したスライドを許可する。このステップでは、アガロースパッドが撮像のために動かないで準備に落ち着くために細胞が可能になります。特別なニーズのためにこの温度は、温度シフト4を必要とする実験を行う際に、例えば、変更が必要な場合があります。
5。パッド自体を削除せずに、各ウェルからの過剰なメディアを離れて吸引除去する。
6。スライドの領域を越え、しっかりと均等に、かつ慎重に押して、スライドにカバースリップを適用します。カバーガラスがスライドに対して、カバースリップがスライド上に上げていないことが確認してください。
細胞の可視化
1。多くの異なる蛍光顕微鏡で問題なく動作します。それは、100X油浸レンズを持つことが重要です。シモンズラボは、使用しています。
- 1,45 NA TIRFM 100Xの油浸対物レンズを搭載したオリンパスBX61顕微鏡
- 浜松ORCAR 2 CCD冷却カメラ
- ルーメン200アークの金属（前）光源。
- GFP（FITC）、フィルタ励起460から500と放射510から560を検出するための
- FM4 - 64の検出（TRITC）に対して、フィルタ励起510〜560および発光572〜648。
- 画像はSlideBook 4.2（図1）を使用して捕獲された
2。白色光を使用してフォーカスに細胞をもたらす。
3。各蛍光体のために適切なフィルタを使用してイメージをキャプチャします。
代表的な結果
代表的なイメージが（図1）が表示されます。 FM4 - 64染色4-7を明るくクリアになるはずですがGFP病巣は、明確に定義する必要があります。 GFPまたは膜の画像は、データを失うことなく、提示される最高品質の画像を可能にするために、任意の色を持つ擬似着色することができます。
図1：Bの代表的なGFPの画像 FM4 - 64膜の染色が赤で表示されている間、 枯草菌の翻訳融合タンパク質を。GFPタンパク質は、緑色で表示されます。白いスケールバーは3μmを示している（）MutS - GFP [関連する遺伝子型：mutS - GFP（SPC）、amyE：：Pspac mutL（猫 ）] 600μg/ mLの2 -アミノプリンおよび1mMのIPTGの存在下で行われる。 FM4 - 64信号がより明確にMutS - GFP病巣を示すために提示されない（B）MutL - GFP [関連する遺伝子型：mutL：：mutL - GFP（SPC）]。。2 -アミノプリンの存在下で（C） DnaX - GFP [関連する遺伝子型：dnaX：：dnaX - GFP（SPC）]。 （D）のRecA - GFP [関連する遺伝子型：recAの：：recAの- GFP（SPC）] 20 ng / mLのマイトマイシンCの（E）TAGC - GFP [関連する遺伝子型の存在下で：TAGC：：TAGC - GFP（SPC） 】1μg/ mLのマイトマイシンCの存在下で
| 治療/濃度または量 | 機能 | インキュベーションの時間 |
| マイトマイシンC（MMC）[20〜150 ng / mLの] | DNAアルキル化剤 | 1時間 |
| 2 - アミノプリン（2 - AP）[600μg/ mLの] | ミスマッチの誘導 | 1時間 |
| ヒドロキシウレア（HU） | dNTPを枯渇させる | 3時間 |
| 紫外線（UV）20 J/m2 | チミン - チミンダイマーと6-4光産物 | 20秒通常は、ソースによって異なります |
| グレー（電離放射線）5〜100 Gyの | 二本鎖切断、一本鎖切断及び塩基損傷部位 | ソースによって異なります |
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント（省略可能） |
| Multitest社スライド、15ウェル | MPのバイオメディカル | 6041505E | |
| 顕微鏡のカバーガラス | フィッシャー | 12から544 - B | |
| アガロース | フィッシャー | BP160 - 500 | |
| マイトマイシンC | シグマ | M0503 - 2mgを | 変異原性、摩耗の手袋 |
| 2 - アミノプリン | シグマ | A3509 - 250mgの | 手袋 |
| ヒドロキシウレア | シグマ | H8627 - 25G | 手袋 |
| FM4 - 64 | インビトロジェン | T13320 | 敏感な光 |
表2。特定の試薬 と機器のリスト：
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Discussion
試行錯誤は、各株の最高品質の画像の露光条件を見つけるために必要とされ、我々は100〜2000ミリ秒のエクスポージャーはGFP（FITC）とFM4 - 64（TRITCに適している間に1ミリ秒は、白色光の画像に適していることを見つける）のイメージ。露光時間は、使用するイメージング機器によって異なります。複数の系統が同じスライド上に存在する場合、パッドの国境から細胞のパッドの品質と拡散は、ひずみの差別化を複雑にする可能性があるので我々は、最も簡単なイメージングのための15ウェル顕微鏡のスライドごとに株の使用をお勧めします。画質は、直接細菌が休んでいるアガロースパッドの品質に依存します。最高品質の画像は、細菌が並んでいるアガロースパッドから取得されます。単分子層を防止する、茂みに細菌細胞を引き起こすパッドは、貧しい人々の画像が生成されます。脱水なパッドが正常に休ませる細胞を許可しない一方厚すぎるパッドは、高いバックグラウンド蛍光シグナルが生成されます。これらのアガロースパッドの欠陥は、通常、非常に悪い画質になります。井戸が悪い画像を生成している場合、単に次のウェルに移ります。それは、画像あたり50〜200個の細胞を捕捉するために理想的です。蛍光顕微鏡は、 生体内の病巣へのDNAの修復や複製タンパク質のアセンブリを指示する細胞の手がかりを詳述した豊富な情報を提供しています。練習すれば、この手法は成功し、多くの細菌種のタンパク質複合体の様々に適用することができます。
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Acknowledgments
著者は、博士に感謝したい。最初に蛍光顕微鏡でLASを訓練するためのPhilina S.リーとアランD.グロスマン。著者らはまた、博士に感謝します。ヘルプとイメージングのためのヒントについてはメラニーBerkmenと肇小林。この作品は、文学、科学芸術の大学から、ミシガン大学、分子細胞、および発生生物学の部門からの資金投入を開始することによってサポートされていました。
Materials
| Specific solution recipes1: | |||
| 10x S750 salts 0.5 M MOPS 100 mM Ammonium Sulfate 50 mM Potassium Phosphate Monobasic Filter sterilize, and wrap S750 media in foil prior to storage |
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| 100x Metals 0.2 M MgCl2 70 mM CaCl2 5 mM MnCl2 0.1 mM ZnCl2 100 μg/mL Thiamine HCl 2 mM HCl 0.5 mM FeCl3* dH2O to final volume *FeCl3 should be added last, to prevent precipitation. After filter sterilization, wrap 100x Metal solution in foil. |
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| S750 media 1x S750 salts 1x Metal 1% Glucose 0.1% Glutamate 40 μg/mL Tryptophan 40 μg/mL Phenylalanine distilled H2O to final volume |
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| 10x Spizizens (grams/L) 151.4 mM Ammonium Sulfate (20g/L) 803.8 mM Potassium Phosphate Monobasic (140g/L) 440.9 mM Potassium Phosphate Dibasic (60g/L) 34.0 mM Sodium Citrate (10g/L) 16.6 mM MgSO4 (2g/L) dH2O to final volume Filter sterilize |
References
- Hardwood, C. R., Cutting, S. M. Molecular Biological Methods for Bacillus. , John Wiley and Sons. Chichester. (1990).
- Berkmen, M. B., Grossman, A. D. Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle. Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).
- Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis. Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).
- Simmons, L. A. Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction. J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).
- Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. Visualization of mismatch repair in bacterial cells. Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).
