קביעת ריאקטיביות Titre של סרום באמצעות Assay Haemagglutination

Summary

Haemagglutination היא סוג של התלכדות שבו הנוגדנים להיקשר לתאי דם אדומים. כדוריות הדם האדומות הן וזמין והתוצאות נצפות בקלות באמצעות בעין בלתי מזוינת. סרט הווידאו הזה ממחיש את שלבים ב assay haemagglutination, לפרש את התוצאות וקביעת titre.

Abstract

Haemagglutination היא צורה ספציפית של התלכדות והוא משמש כאשר נוגדנים נקשרים לתאי דם אדומים, אשר פועלים כמו אנטיגן חלקיקי. כדוריות דם אדומות מטרות שימושי במיוחד כאשר הם זמינים ו התלכדות הוא הנצפה באמצעות בעין בלתי מזוינת. טכניקה זו משמשת בדרך כלל כדי לקבוע את titre של נוגדן (AB), עבור קיבוץ דם וכימות ויראלי. בסרטון הזה, השלבים מעורבים בהכנת וביצוע assay haemagglutination מודגמת באמצעות נוגדנים ספציפיים לקבוצת דם A-אנטיגנים להוסיף כדוריות דם אדומות (Revercells). Antiserum הוא מדולל סדרתי בתוך מגש 96 גם microtitre U-התחתונה, שאליו מתווסף השעיה של Revercells. דגימות הן מעורבות מודגרות אז 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. לאחר תקופה זו, הדגימות אז יכול להיות הבקיע בקלות יש, יש + ביניים התגובות (-/+) haemagglutination. גישה זו מאפשרת תגובתיות ו titre מדגם בסרום להיות מוערך באמצעות טכניקה מהירה ופשוטה. הווידאו יכסה את התיאוריה מאחורי assay, איך התוצאות לקרוא ולפרש, איך titre נקבע, כיצד assay יכולות להיות משונות כל הנושאים הקשורים לשימוש בטכניקה זו.

Protocol

הכנת תמיסת מלח 5x שנאגרו ורונל (VBS)

1. כדי להכין את תמיסת מלח שנאגרו ורונל (VBS), שלושה פתרונות שונים צריכים להיות מוכנים.
2. הכן פתרון 1 על ידי המסת 21.25gm של NaCl ו 0.94gm של Barbitone נתרן 350ml של מים מזוקקים. הריכוזים הסופי של Barbitone NaCl נתרן הם 1.02M ו 13 מ"מ בהתאמה.
3. הכן פתרון 2 על ידי המסת 1.44gm של Barbitone ב 125ml של מים מזוקקים חמים. הריכוז הסופי של Barbitone הוא 62.5mM.
4. הכן פתרון 3 על ידי המסת 20.33gm של MgCl ₂ ו 4.41gm של CaCl ₂ ב 100 מ"ל של מים מזוקקים. הריכוז הסופי של MgCl ₂ ו CaCl ₂ הוא 2.18M ו 440mM בהתאמה.
5. מיקס פתרונות 1 ו 2 ו להתקרר לטמפרטורת החדר.
6. לאחר פתרון משולב מתקרר, להוסיף 1.25 מ"ל של תמיסת 3 ולהתאים את ה-pH על 7.3-7.5 באמצעות 1M HCl.
7. התאמת עוצמת השמע הסופי 500ml עם מים מזוקקים להכין פתרון מניות 5x.
8. כדי להכין פתרון עובד 1x, לדלל את המניות 1:05 עם מים מזוקקים.

דילול של Revercells

1. בעדינות resuspend הפתרון המניות של Revercells על ידי היפוך ולאחר מכן להסיר 1ml של תאים בצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 600g ב 4 ° C.
2. לאחר צנטריפוגה, בזהירות להסיר את supernatant ו resuspend התאים 3ml של 1x ורונל שנאגרו מלוחים.
3. התאים כעת ניתן לאחסן על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

נוהל

1. העברה של 50 מ"ל 1x VBS לשורות A1-A12 של צלחת 96 U היטב לתחתית.
2. כדי A1 ובכן, להוסיף 50μl של אנטי סרום ומערבבים היטב בעזרת פיפטה.
3. בעזרת פיפטה קצה טריים, להסיר 50μl של נוזל מתוך A1 היטב ולהעביר אותו A2 היטב. מערבבים היטב לחזור על תהליך זה עד שתגיע גם A11 ואז להשליך את 50μl האחרון מהבאר הזאת.
4. המדגם סרום עתה בדילול סדרתי פי 2 מ - 01:02 עד 1:2048. סרום לא מתווסף ובכן A12 כמו זו הוא שליטה VBS שלילית.
5. אם יש יותר מדגם אחד בסרום תוערך, חזור על שלבים 4.1-4.4 עבור שורה ב 'וכו'
6. לאחר כל דילולים נעשו, להוסיף 50μl Revercells של 1% על כל בארות. הערה: Revercells יתייצב לאורך זמן צריך להיות מושעה בעדינות לפני שהוא חילק לתוך בארות.
7. מערבבים בעדינות את הדגימות על ידי הקשה על הצד של המגש microtitre, מכסים ומניחים את התגובה haemagglutination להמשיך עבור 1h על 37 ° C. חדר באינקובטור מחומם כראוי או יכול לשמש.
8. לאחר דגירה, להסיר בזהירות את המגש מן החממה ולבחון את צלחת haemagglutination. השליטה VBS גם צריכים להיות הראשונים שנבדקו היטב. אם התגובה היא שלילית, אז התוצאות אינן תקפות. אם המדגם VBS מציג תוצאה haemagglutination חיובי, אז התוצאות לא ניתן להשתמש ותהליך יש לחזור. תגובה חיובית haemagglutination יופיע כגיליון רחבה על בסיס של הבאר, זמן תגובה שלילית תופיע בתור גלולה מרוכזת קטן של תאים במרכז הבאר. התוצאה ביניים תהיה הילה של תאים חיובי עם גרעין מרכזי של תאים pelleted. תוצאה זו מתרחשת כאשר בסרום יש כמה Ab שיכול להגיב, אבל כמויות מספיקות של Ab לגרום תגובת מלא.
9. החלק תוצאות נציג יש שני ייצוגים שבתרשים של התוצאות הצפויות. דוגמה של קבוצה לא חוקית ותקפה תוצאות מסופק. Titre עבור אנטי סרום יהיה גם נקבע.

נציג תוצאות:

וידאו כולל דוגמה תוצאות נציג. להלן (Fig1 ו איור 2) הן שתי דוגמאות הראו באופן שבתרשים. הדוגמה הראשונה היא של תגובה, כי לא ניתן לפרש את השליטה VBS היא חיובית, ואילו השנייה היא assay תקף המאפשר titre שייקבע.

באיור 1. דוגמה haemagglutination שבו תוצאה חיובית נכשלה. בייצוג שבתרשים לעיל, התגובה heamagglutination אינו יכול להתקבל. השליטה בסרום VBS שלילי מציג התגובה haemagglutination חיובי כפי שמעידים היווצרות גיליון בבסיס הבאר. זה מצביע על כך אירעה שגיאה והתוצאות לא יכול להתקבל. במקרה זה, התהליך צריך להיות חוזרות ונשנות.

איור 2. דוגמה haemagglutination שבו תוצאה חיובית עבד כראוי. בייצוג שבתרשים, התגובה heamagglutination תקף. השליטה VBS שלילי מציגה תגובה שלילית haemagglutinationזה לידי ביטוי על ידי גלולה שנוצרה בבסיס הבאר. גם חיובי האחרון בשורה 7, אשר מצביע על כך titre למדגם הזה בסרום היא 128 (כלומר הגומלין של 1 / 128). זו תהיה דוגמה של נוגדן כי נוכח כמויות מתונות בנסיוב.

Discussion

Assay haemagglutination היא טכניקה פשוטה המאפשרת למספר רב של דגימות נסיוב להיות מוערך בתוך פרק זמן קצר. כמו כן, יש את היתרון של להיות לקרוא ללא צורך בציוד מיוחד, עם העין להיות מתאים. טכניקה זו יכולה גם להיות שונה לצורך זיהוי של ההורמון האנושי gonadotrophin כוריוני בשתן, כחלק מבחן haemagglutination-עיכוב. ביחס למבחן haemagglutination תקן, ישנם אזורים מעטים שבהם טיפול צריך לקחת על מנת assay להתבצע כראוי. ראשית, טכניקה זו מתבססת על יישוב של תאים על משטח קעור. ככזה, הוא חיוני צלחת U-או עגול microtitre התחתונה היא בשימוש. שימוש בצלחת תחתית שטוחה כמו משמש בדרך כלל ELISA אינו מתאים, כמו תגובות שליליות וחיוביות יופיעו זהה. כמו כן יש להעריך שכאשר דגימות סרום שונים משמשים, נוגדנים תגובתי צפויים להיות בריכוזים שונים. בריכוז נוגדנים גבוה, אנטיגן (Revercells) עשוי להיות הגבלת אפקט prozone אפשר לראות. אולם זה לא ישפיע על קביעת הערך titre, שכן זה נקבע להיות גם האחרון שבו תגובה חיובית נראתה לאחרונה. לבסוף, טכניקה זו אינה כמותית, רמת המוחלט של נוגדנים תגובתי בנסיוב אינה ידועה. עם זאת, ברוב המקרים אין צורך בכך, במיוחד כאשר קביעת תגובתיות כדי אנטיגן ידוע הוא את כל המידע הנדרש.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Revercells	CSL	02490201	Use at 1% final
Anti-A serum	CSL	02611305
96 well U bottom plate	TRP	92097	Must be U-bottom
Veronal buffered saline			Use at 1x final
37°C room/incubator
Disposable gloves