Summary
Haemagglutination هو شكل من أشكال تراص حيث ربط الأجسام المضادة خلايا الدم الحمراء. خلايا الدم الحمراء على حد سواء متوفرة بسهولة ويمكن ملاحظتها بسهولة النتائج باستخدام العين المجردة. هذا الفيديو يوضح الخطوات المتبعة في فحص haemagglutination ، وتفسير النتائج وتحديد عيار.
Abstract
Haemagglutination هو شكل محدد من تراص وتستخدم الأجسام المضادة عند ربط خلايا الدم الحمراء ، والتي تكون بمثابة مستضد الجسيمات. خلايا الدم الحمراء هي أهداف مفيدة بشكل خاص لأنها متاحة بسهولة ، ويمكن ملاحظتها تراص باستخدام العين المجردة. ويشيع استخدام هذه التقنية لتحديد عيار وجود الأجسام المضادة (AB) ، لتجميع الدم والكمي الفيروسي. في هذا الفيديو ، ويتجلى في الخطوات المتبعة في إعداد وإجراء مقايسة haemagglutination باستخدام الاجسام المضادة المحددة لفئة الدم A المستضدات المضافة لخلايا الدم الحمراء (Revercells). غير المخفف متسلسل للمصل في 96 علبة جيدا microtitre U - القاع ، والتي يتم إضافة تعليق Revercells. يتم خلط العينات والمحتضنة ثم عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. بعد هذا الوقت ، يمكن عندئذ أن تكون هذه العينات وسجل بسهولة لهاء ، هاء + وردود الفعل وسيطة haemagglutination (-/+). هذا النهج يتيح التفاعل وعيار عينة مصل ليتم تقييمها باستخدام تقنية سريعة وبسيطة. وسوف تغطي الفيديو نظرية وراء مقايسة ، وكيف تتم قراءة النتائج وتفسيرها ، وكيف يتم تحديد عيار ، وكيف يمكن تعديل أي مقايسة والقضايا المرتبطة باستخدام هذه التقنية.
Protocol
إعداد المالحة Veronal 5X التخزين المؤقت (VBS)
- لإعداد المالحة Veronal التخزين المؤقت (VBS) ، وثلاثة حلول فصل ابد أن نكون مستعدين.
- 1 إعداد حل عن طريق إذابة 21.25gm من كلوريد الصوديوم و0.94gm باربيتون من الصوديوم في 350ml من الماء المقطر. تركيزات النهائي للباربيتون والصوديوم وكلوريد الصوديوم 1.02M و13mM على التوالي.
- 2 إعداد حل عن طريق إذابة 1.44gm من باربيتون في 125ml من الماء المقطر الساخن. التركيز النهائي هو باربيتون 62.5mM.
- 3 إعداد حل عن طريق إذابة 20.33gm من MgCl 2 و 4.41gm من CaCl 2 في 100ML من الماء المقطر. التركيز النهائي للMgCl 2 و 2 CaCl هو 2.18M و440mM على التوالي.
- مزيج حلول 1 و 2 وتبرد لدرجة حرارة الغرفة.
- مرة واحدة في الجمع بين الحل والمبردة ، إضافة 1.25 مل من محلول (3) وضبط درجة الحموضة إلى 7،3-7،5 باستخدام حمض الهيدروكلوريك 1M.
- ضبط الحجم النهائي ل500ml بالماء المقطر لإعداد محلول المخزون 5X.
- لإعداد حل 1X العمل ، ويخفف من 1:05 الأسهم مع الماء المقطر.
تخفيف Revercells
- resuspend بلطف حل سهم Revercells بواسطة انقلاب ثم إزالة 1ml من الخلايا وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 600G في 4 درجات مئوية.
- بعد الطرد المركزي ، وإزالة بعناية وطاف resuspend الخلايا في 3ml من 1X Veronal التخزين المؤقت المالحة.
- ويمكن الآن أن الخلايا المخزنة في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
إجراء
- نقل 50ml من VBS 1X في صفوف A1 - A12 من 96 لوحة أسفل جيدا يو.
- إلى A1 حسنا ، إضافة 50μl من ألف مصل مضاد ومزيج دقيق باستخدام ماصة.
- تلميح باستخدام ماصة العذبة ، وإزالة 50μl السائل من A1 جيدا وتحويلها إلى A2 جيدا. مزيج دقيق وتكرار هذه العملية حتى تصل جيدا A11 ثم تجاهل 50μl الماضي من هذه البئر.
- عينة مصل وقد تم الآن المخفف متسلسل 2 أضعاف من 01:02 إلى 1:2048. يضاف إلى أي مصل A12 حسنا لأن هذا هو التحكم VBS سلبية.
- إذا كان أكثر من عينة مصل أن يكون المقررة ، وكرر الخطوات من 4،1-4،4 للصف B الخ.
- مرة واحدة وبذلت كل التخفيفات ، إضافة 50μl Revercells من 1 ٪ لجميع الآبار. ملاحظة : سوف Revercells تسوية مع مرور الوقت ويجب وقف بلطف قبل أن يتم الاستغناء في الآبار.
- مزج عينات بالنقر برفق على جانب الدرج microtitre ، وغطاء وترك رد الفعل للمضي قدما لhaemagglutination 1H عند 37 درجة مئوية. يمكن استخدام الغرفة أو حاضنة مناسبة ساخنة.
- التالية الحضانة ، وإزالة بعناية من علبة الحاضنة ودراسة لوحة haemagglutination. التحكم VBS ينبغي كذلك أول درس جيدا. إذا كان رد الفعل سلبيا ، ثم تكون النتائج صحيحة. إذا كانت العينة VBS يظهر نتيجة إيجابية haemagglutination ، فلا يمكن استخدام نتائج وينبغي تكرار هذه العملية. وهناك رد فعل إيجابي haemagglutination تبدو وكأنها ورقة واسعة على قاعدة من البئر ، في حين أن رد الفعل السلبي سوف تظهر بيليه مركزة صغيرة من الخلايا في وسط البئر. ونتيجة وسيطة لها هالة من الخلايا إيجابية مع نواة مركزية من الخلايا مكعبات. هذه النتيجة كما يحدث في مصل الدم لديه بعض أب التي يمكن أن تتفاعل ، ولكن كميات كافية من أب لإحداث تفاعل كامل.
- المقطع النتائج ممثل تمثيل بياني اثنين من النتائج المتوقعة. وقدمت مثالا على مجموعة غير صالحة وسارية المفعول من النتائج. سيتم أيضا لعيار المصل المضاد يتم تحديدها.
ممثل النتائج :
شريط فيديو يتضمن مثالا على نتائج ممثلة. أدناه (Fig1 والشكل 2) مثالين معروضة بطريقة البيانية. المثال الأول هو رد فعل لا يمكن أن تفسر على أنها عنصر التحكم VBS إيجابية ، في حين أن الثاني هو مقايسة صالحة تسمح للعيار يحدد لاحقا.
الشكل 1. مثال haemagglutination حيث فشلت نتيجة إيجابية. في تمثيل بياني أعلاه ، لا يمكن رد الفعل heamagglutination لا يمكن قبوله. سيطرة سلبية المصل VBS يعرض رد فعل إيجابي haemagglutination كما يستدل على ذلك من تشكيل ورقة في قاعدة البئر. هذا يشير إلى أن خطأ قد وقع ، ولا يمكن أن تكون النتائج مقبولة. في هذه الحالة ، ينبغي تكرار هذه العملية.
الشكل 2. مثال haemagglutination حيث النتيجة الإيجابية عملت بشكل صحيح. في تمثيل بياني ، فإن رد الفعل heamagglutination صالح. التحكم VBS يعرض رد فعل سلبي haemagglutination السلبيق يتضح من بيليه التي شكلت في الأساس من البئر. البئر مشاركة الإيجابية الصف 7 ، الذي يشير إلى أن عيار المصل لهذه العينة هو 128 (أي متبادلة من 128 / 1). هذا من شأنه أن يكون مثالا للجسم التي موجود في كميات معتدلة في المصل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في مقايسة haemagglutination هي تقنية بسيطة جدا التي تسمح لعدد كبير من العينات التي سيتم تقييمها مصل في غضون فترة قصيرة من الزمن. كما أن لديها ميزة كونها قراءة دون الحاجة إلى المعدات المتخصصة ، مع العين يجري مناسبة. ويمكن أيضا أن يتم تعديل هذه التقنية للكشف عن هرمون موجهة للغدد التناسلية المشيمية موجودة في البول ، وكجزء من اختبار haemagglutination تثبيط. بالنسبة لاختبار haemagglutination القياسية ، وهناك عدد قليل من المناطق حيث احتياجات الرعاية التي ينبغي اتخاذها من أجل أن الفحص الذي سيتم تنفيذه بشكل صحيح. أولا ، تستند هذه التقنية على تصفية الخلايا على سطح مقعر. على هذا النحو ، فمن الضروري أن يتم استخدام U - أو جولة لوحة microtitre القاع. استخدام لوحة مسطحة القاع كما يستخدم عادة لإليسا ليست مناسبة ، وردود الفعل السلبية والايجابية سوف تظهر متطابقة. وينبغي أيضا أن يكون موضع تقدير عند استخدام عينات مصلية مختلفة ، وأضداد رد الفعل من المرجح أن يكون حاضرا في تركيزات مختلفة. في تركيز الضد عالية ، قد مستضد (Revercells) يمكن أن تكون مقيدة ويمكن ملاحظة أثر طليعة المنطقة. لكن هذا لن يؤثر على تحديد قيمة عيار ، حيث يتم تحديد ذلك بأنها البئر الماضي حيث شوهد للمرة الاخيرة ردود فعل إيجابية. أخيرا ، هذه التقنية ليست كمية ، وليس معروفا على المستوى المطلق للجسم على رد الفعل في المصل. ومع ذلك ، في معظم الحالات ، هذا ليس ضروريا ، وبخاصة عندما عزم على تفاعل المستضد المعروف هو كل المعلومات المطلوبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ويود الكاتب أن أشكر الآنسة لورا ماثيوز لأداء هذه التقنية ، والسيد بول الراعي لصناعة السينما. وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل جامعة جنوب أستراليا ، مختبر برنامج الطب.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Revercells | CSL | 02490201 | Use at 1% final |
| Anti-A serum | CSL | 02611305 | |
| 96 well U bottom plate | TRP | 92097 | Must be U-bottom |
| Veronal buffered saline | Use at 1x final | ||
| 37°C room/incubator | |||
| Disposable gloves |
