确定使用血凝检测血清中的反应和滴度

Summary

血凝是抗体结合到红细胞的凝集形成。红血细胞都是现成的，结果很容易用肉眼观察。本视频演示了在血凝实验所涉及的步骤，解释的结果，并确定滴度。

Abstract

血凝是一种特定的凝集的形式，使用时红血细胞，它作为颗粒性抗原抗体结合。红血细胞是特别有用的目标，因为他们都是现成的，是用肉眼观察凝集。这种技术常用来确定的抗体滴度（AB），血型和病毒定量。在这个视频，在编制和执行血凝检测所涉及的步骤演示使用一个抗原添加到红血细胞（Revercells）血型特异性抗体。抗血清稀释96以及U型底酶标托盘，这是增加了一个悬挂的Revercells的。样本混合在一起，然后在37 ° C孵育60分钟。过了这段时间，样品可以很容易地取得VE，+ ve和中间的(-/+)血凝反应。此方法允许使用一个快速和简单的的技术进行评估血清样品的活性和滴度。视频将覆盖检测背后的理论，如何理解和解释的结果是，如何确定滴度是可以修改，如何检测和使用这项技术与相关的任何问题。

Protocol

制备的5倍Veronal缓冲液（VBS）

1. 要准备Veronal缓冲液（VBS），3个单独的解决方案都需要做好准备。
2. 准备通过溶解在蒸馏水350毫升NaCl和0.94gm钠巴比妥21.25gm溶液1。氯化钠和钠巴比妥终浓度分别为1.02M和13MM。
3. 准备通过溶解在热蒸馏水125毫升巴比妥1.44gm溶液2。巴比妥最终浓度62.5mM。
4. 准备通过溶解在蒸馏水100ml _氯化钙氯化镁₂和4.41gm 20.33gm溶液3。 ₂氯化镁和氯化钙₂终浓度分别是218万和440MM。
5. 混合解决方案1和2，冷却到室温。
6. 一旦合并的解决方案已经冷却，加1.25毫升溶液3，使用1M盐酸调节pH值至7.3-7.5。
7. 调整最终体积至500ml，用蒸馏水，准备了5倍​​原液。
8. 为了准备1X的工作方案，用蒸馏水稀释股票1:5。

稀释的Revercells

1. 轻轻重悬的颠倒Revercells的股票解决方案，然后取出在600克1毫升的细胞和离心5分钟，在4 ° C。
2. 离心后，小心取出上清液，重悬细胞在1X3毫升Veronal缓冲液。
3. 现在可以将这些细胞保存在4 ° C，直到使用。

程序

1. 96以及ü底板行A1 - A12转移到1X的VBS50毫升。
2. 孔A1，添加抗的血清50μL调匀使用吸管。
3. 使用一个新的枪头，删除以及A1液50μL和转让以及A2。调匀，重复这一过程，直到您到达以及A11和然后放弃这口井从去年50μL。
4. 血清样品现已连续稀释2倍，从1:2到1:2048。无血清添加到井A12，因为这是VBS的阴性对照。
5. 如果有多个血清样本进行评估，重复步骤B行等4.1-4.4
6. 一旦所有的稀释已添加1％Revercells50μL所有油井。注：Revercells将定居随着时间的推移，应轻轻暂停配发入井前。
7. 混合样品的微量托盘一侧轻轻拍打，盖，血凝反应进行1H在37 ° C可用于孵化器或适当加热室。
8. 孵化，从孵化器小心地取出托盘和检查血凝板。 VBS的控制以及应很好研究的。如果反应是否定的，那么结果是有效的。如果VBS示例显示了一个积极血凝结果，然后将结果不能被使用过程中应反复。积极血凝反应会出现广泛负债表上的良好的基础，而消极的反应将作为一个小型的浓缩颗粒细胞出现在井的中心。中间结果将阳性细胞与颗粒细胞的核心的光环。血清有一定的抗体，可以反应这种结果发生，但AB的不足造成一个完整的反应。
9. 部分代表结果预期的结果有两个图表交涉。结果无效，并有效设置的一个例子。的抗血清的滴度也将确定。

代表性的成果：

视频包括代表性的成果的一个例子。下面（图1，图2）是在图表的方式显示的两个例子。第一个例子是一个不能被解释为VBS的控制是积极的反应，而第二个是一个有效的检测，要确定的滴度。

图1血凝的一个例子 。阳性结果失败。在上面的图解，heamagglutination反应是不能接受的。 VBS的血清阴性对照，显示了积极的血凝反应，由表形成良好的基础。这表明发生了错误和不能接受的结果。在这种情况下，这个过程应该是重复的。

图2：一个积极的结果已经正确的血凝的一个例子。在图形表示，heamagglutination反应是有效的。的VBS阴性对照显示负血凝反应小号证明的沉淀，已形成良好的基础。最后积极井是第7行，这表明，此血清样本的滴度为128（即1 / 128的倒数）。这将是一种抗体，是存在于血清中适量的例子。

Discussion

血凝检测是一个非常简单的的技术，允许大量的血清样本，将在很短的时间内评估。它还具有无需要专门的设备读取的优势，与合适的眼睛。这种技术也被修改为检测尿中的人绒毛膜促性腺激素激素，作为一个血凝抑制试验的一部分。在有关标准的血凝试验，有一个需要注意的是为了正确执行检测的几个领域。首先，这项技术是基于一个凹面上的细胞沉淀。因此，至关重要的是，使用一个U型或圆底微孔板。使用平坦的底板，通常用于ELISA不适合，会出现相同的消极和积极的反应。也应该明白，使用不同的血清样本时，反应的抗体可能是目前在不同浓度的。在高浓度抗体，抗原（Revercells）可能会限制和可观察到一个前带效应。然而，这不会影响滴度价值的决心，因为这是积极的反应是最后一次露面是去年以及确定。最后，这种技术是不定量的，反应性抗体的血清中的绝对水平是不知道。然而，在大多数情况下，这是没有必要，尤其是当已知抗原反应的决心是所需的所有信息。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Revercells	CSL	02490201	Use at 1% final
Anti-A serum	CSL	02611305
96 well U bottom plate	TRP	92097	Must be U-bottom
Veronal buffered saline			Use at 1x final
37°C room/incubator
Disposable gloves