La determinación de la reactividad y el título de suero utilizando un ensayo de hemaglutinación

Summary

Hemaglutinación es una forma de aglutinación de los anticuerpos se unen a los glóbulos rojos. Los glóbulos rojos están disponibles de inmediato y los resultados son fácilmente observables a simple vista. Este video muestra los pasos a seguir en un ensayo de hemaglutinación, la interpretación de los resultados y determinar el título.

Abstract

Hemaglutinación es una forma específica de aglutinación y se utiliza cuando los anticuerpos se unen a los glóbulos rojos, que actúan como antígenos de partículas. Los glóbulos rojos son blancos particularmente útiles, ya que son fácilmente disponibles y la aglutinación es observable a simple vista. Esta técnica se utiliza comúnmente para determinar el título de un anticuerpo (Ab), para la determinación de grupos sanguíneos y la cuantificación viral. En este video, los pasos a seguir en la preparación y la realización de un ensayo de hemaglutinación se demuestra el uso de anticuerpos específicos de antígenos de grupo sanguíneo A agregado a los glóbulos rojos (Revercells). El antisuero se diluyen en serie en un 96 y U-abajo la bandeja de microtitulación, al que se añade una suspensión de Revercells. Las muestras se mezclaron y se incubaron a 37 º C durante 60 minutos. Después de este tiempo, las muestras pueden ser fácilmente anotó para ve, ve + e intermedios hemaglutinación reacciones (-/+). Este enfoque permite la reactividad y el título de una muestra de suero que se evaluó a través de una técnica rápida y sencilla. El vídeo cubre la teoría detrás de la prueba, como los resultados son leídos e interpretados, ¿cómo determinar el título, como el ensayo se pueden modificar y todo lo relacionado con el uso de esta técnica.

Protocol

Preparación de 5x buffer salino veronal (VBS)

1. Para preparar la solución salina tamponada con veronal (VBS), tres soluciones distintas que estar preparados.
2. Prepare una solución de 1 por disolución de NaCl y 21.25gm 0.94gm de barbital sódico en 350 ml de agua destilada. Las concentraciones finales de la barbitona NaCl y de sodio son 1.02m y 13 mm respectivamente.
3. Prepare una solución de 2 por disolución de 1.44gm barbitona en 125 ml de agua destilada caliente. La concentración final de barbitona es 62,5 mm.
4. Prepare una solución de 3 por disolución 20.33gm de MgCl ₂ y 4.41gm de _CaCl2 en 100 ml de agua destilada. La concentración final _de MgCl2 y _CaCl2 es 2,18 m y 440 mm respectivamente.
5. Mezclar las soluciones 1 y 2 y enfriar a temperatura ambiente.
6. Una vez que la solución combinada se ha enfriado, añadir 1,25 ml de la solución 3 y ajustar el pH a 7,3-7,5 con HCl 1M.
7. Ajustar el volumen final de 500 ml con agua destilada para preparar una solución de 5x.
8. Para preparar una solución de trabajo 1x, diluir la 1:05 madre con agua destilada.

La dilución de Revercells

1. Resuspenda suavemente la solución madre de Revercells por inversión y se retire de 1 ml de células y centrifugar durante 5 minutos a 600 g a 4 ° C.
2. Después de la centrifugación, retire con cuidado el sobrenadante y resuspender las células en 3 ml de solución salina tamponada con veronal 1x.
3. Las células se pueden almacenar a 4 ° C hasta su uso.

Procedimiento

1. Transferencia de 50 ml de 1x VBS en filas A1-A12 de una placa de 96 pocillos fondo U.
2. Bueno a A1, agregar 50μl de suero anti-A y mezclar bien con una pipeta.
3. Usando una punta de pipeta, retire 50μl de líquido del pozo A1 y la transferencia a bien A2. Mezclar bien y repetir este proceso hasta llegar así A11 y luego desechar el pasado 50μl de este pozo.
4. La muestra de suero se ha diluido en serie dos veces, pasando de 1:2 a 1:2048. No añadir suero al bien A12, ya que es el control de la EBV negativos.
5. Si más de una muestra de suero se ha de evaluar, repita los pasos 4.1-4.4 para la fila B, etc
6. Una vez que todas las diluciones se han hecho, añadir 50μl de Revercells 1% a todos los pocillos. Nota: El Revercells se asentarán en el tiempo y deben ser cuidadosamente suspendidos antes de que se dispensa en los pozos.
7. Mezclar las muestras golpeando suavemente en el lado de la bandeja de microtitulación, cubrir y dejar que la reacción de hemaglutinación para proceder a 1h a 37 ° C. Una sala de incubadora o calefacción adecuada se puede utilizar.
8. Después de la incubación, retire con cuidado la bandeja de la incubadora y examinar la placa de la hemaglutinación. El control de VBS, así debería ser el primero muy concretos. Si la reacción es negativa, entonces los resultados son válidos. Si la muestra VBS muestra un resultado positivo de la hemoaglutinación, los resultados no se pueden utilizar y el proceso se debe repetir. Una reacción de hemaglutinación positiva aparecerá como una hoja amplia en la base del pozo, mientras que una reacción negativa aparece como una pequeña bolita de células concentradas en el centro del pozo. Un resultado intermedio tendrá un halo de células positivas con un núcleo central de las células granuladas. Este resultado se produce como el suero tiene Ab que puede reaccionar, pero una cantidad insuficiente de Ab para provocar una reacción completa.
9. La sección de resultados representante tiene dos representaciones gráficas de los resultados esperados. Un ejemplo de un conjunto inválido y válida de los resultados se proporciona. El título de anti-suero también se determinará.

Los resultados representativos:

El video incluye un ejemplo de resultados representativos. A continuación (Fig. 1 y Fig. 2) son dos ejemplos que se muestran de manera esquemática. El primer ejemplo es de una reacción que no puede ser interpretado como el control VBS es positivo, mientras que el segundo es un análisis válido que permita el título por determinar.

Figura 1. Un ejemplo de la hemaglutinación en el resultado positivo ha fallado. En la representación esquemática más arriba, la reacción heamagglutination no puede ser aceptada. El control de suero negativo VBS muestra una reacción de hemaglutinación positiva como lo demuestra la formación de la hoja en la base del pozo. Esto indica que ha habido un error y los resultados no pueden ser aceptadas. En este caso, el proceso debe ser repetido.

Figura 2. Un ejemplo de la hemaglutinación en el resultado positivo se ha realizado correctamente. En la representación esquemática, la reacción heamagglutination es válido. El control VBS negativo muestra una reacción de hemaglutinación negativa unas lo demuestra el sedimento que se ha formado en la base del pozo. El último es muy positiva la fila 7, lo que indica que el título de esta muestra de suero es de 128 (es decir, la inversa de 1 / 128). Este sería un ejemplo de un anticuerpo que está presente en cantidades moderadas en el suero.

Discussion

La hemaglutinación es una técnica muy sencilla que permite un gran número de muestras de suero a evaluar en un corto período de tiempo. También tiene la ventaja de ser leído sin necesidad de equipo especializado, con el ojo que está siendo adecuada. Esta técnica también puede ser modificado para la detección de la hormona gonadotropina coriónica humana en la orina, como parte de una prueba de inhibición de la hemaglutinación. En relación con una prueba de hemaglutinación estándar, hay algunas áreas donde el cuidado se debe tener para que el ensayo se realice correctamente. En primer lugar, esta técnica se basa en el asentamiento de las células sobre una superficie cóncava. Por lo tanto, es esencial que un fondo de U o redondas placa de microtitulación se utiliza. El uso de una placa de fondo plano que se utiliza comúnmente para ELISA no es adecuado, ya que las reacciones negativas y positivas que parecen idénticas. También debe tenerse en cuenta que cuando diferentes muestras de suero se utilizan anticuerpos reactivos es probable que se presente en diferentes concentraciones. En la concentración de anticuerpos de alta, el antígeno (Revercells) puede ser limitante y un efecto prozona puede ser observada. Sin embargo, esto no afectará a la determinación del valor de título, ya que esta se determina como el último y donde se vio una reacción positiva pasado. Por último, esta técnica no es cuantitativa, el nivel absoluto de anticuerpo de reacción en el suero no es conocida. Sin embargo, en la mayoría de los casos esto no es necesario, sobre todo cuando la determinación de la reactividad a un antígeno se conoce toda la información que se requiera.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Revercells	CSL	02490201	Use at 1% final
Anti-A serum	CSL	02611305
96 well U bottom plate	TRP	92097	Must be U-bottom
Veronal buffered saline			Use at 1x final
37°C room/incubator
Disposable gloves