赤血球凝集アッセイを用いて血清の反応性と力価の決定

Summary

赤血球凝集は、抗体が赤血球に結合凝集の形式です。赤血球は、両方とも容易に入手可能であり、結果は容易に肉眼を使って観測している。このビデオでは、結果を解釈し、力価を決定する、赤血球凝集アッセイに必要な手順を示しています。

Abstract

赤血球凝集は凝集の特定の形式であり、抗体が粒子状抗原として​​機能する赤血球、にバインドするときに使用されます。赤血球は、容易に入手できるように特に有用な標的であると凝集は肉眼を用いて観測される。この手法は、一般的に血液型判定およびウイルス定量のために、抗体（Ab）の力価を決定するために使用されます。このビデオでは、赤血球凝集アッセイの準備と実行に必要なステップは、血液型抗原は、赤血球（Revercells）に追加するに特異的な抗体を用いて示されています。抗血清は、シリアルRevercellsの懸濁液を添加された96ウェルU底マイクロタイタートレイ、中に希釈される。サンプルを混合し、その後60分間37℃でインキュベートする。この時間後、次いで、試料を容易にVE、+ VEと中間(-/+)の赤血球凝集反応のために得点することができます。このアプローチは、迅速かつ簡単な手法を用いて評価される血清サンプルの反応性と力価が可能になります。ビデオは、アッセイを変更する方法、力価が決定される方法、結果を読み、どのように解釈されるか、分析の背後にある理論をカバーし、この技術の使用に関連するあらゆる問題になります。

Protocol

5倍のベロナール緩衝生理食塩水の調製（VBS）

1. ベロナール緩衝生理食塩水（VBS）を準備するには、3つの別々のソリューションが用意する必要があります。
2. 蒸留水の350ミリリットルでナトリウムBarbitoneのNaClおよび0.94gmの21.25gmを溶解して溶液1を準備します。 NaClおよびナトリウムBarbitoneの最終濃度は、それぞれ1.02Mと13mmです。
3. ホット蒸留水の125​​ミリリットルでBarbitoneの1.44gmを溶解して溶液2を準備します。 Barbitoneの最終濃度が62.5mMである。
4. 蒸留水の100mlにCaCl ₂のMgCl ₂と4.41gmの20.33gmを溶解して溶液3を準備。 MgCl ₂とCaCl ₂の最終濃度は2.18M、それぞれ440mMである。
5. ミックスのソリューション1と2と室温まで冷却。
6. 組み合わせた溶液を冷却した後、溶液3の1.25 mlを追加し、1M HClを用いて7.3から7.5にpHを調整する。
7. 5倍のストック溶液を調製するために蒸留水で500ミリリットルに、最終的な音量を調整します。
8. 1Xワーキング溶液を調製するために、蒸留水で株式1:5に希釈する。

Revercellsの希釈

1. 静かに転倒混和してRevercellsのストック溶液を再懸濁し、その後4℃で600グラムで5分間細胞および遠心の1mlを取り除く℃に
2. 遠心後、上清を慎重に除去し、ベロナール緩衝生理食塩液1Xの3ミリリットルで細胞を懸濁します。
3. 細胞は現在、4℃で使用時まで保存することができます。

手順

1. 行96ウェルU底プレートのA1 - A12に1X VBS 50mlのを転送する。
2. まあA1に、抗血清50μlのを追加し、ピペットを用いてよく混ぜる。
3. 新鮮なピペットチップを使用して、よくA1から液体の50μlのを削除してもA2に転送します。完全に混和して、よくA11に到達し、この井戸から最後の50μlのを破棄するまで、このプロセスを繰り返します。
4. 血清サンプルは、現在シリアル1:2から1:2048に2倍に希釈されています。これはVBSネガティブコントロールであるため、血清はよくA12に追加されません。
5. 複数の血清サンプルを評価する場合、Bなどの行のためのステップ4.1から4.4を繰り返します。
6. 一度全ての希釈が行われている、すべてのウェルに1％のRevercells50μlの追加。注：Revercellsは時間をかけて解決し、穏やかにウェルに分注される前に中断されるべきである。
7. 軽くマイクロタイタートレイの側面にタップすることによってサンプルを混合、37℃で1時間進行さ血球凝集反応をカバーし、残す℃のインキュベーターまたは適切に加熱室を使用することができます。
8. インキュベーション後、慎重にインキュベーターからトレイを取り外して、赤血球凝集のためのプレートを調べます。 VBSのコントロールは、よくよく調べ最初にしてください。反応が負の場合、結果は有効です。 VBSのサンプルが陽性赤血球凝集の結果が表示されている場合、結果は使用することができるとプロセスを繰り返す必要があります。否定的な反応がウェルの中央のセルの小さな濃厚ペレットとして表示されますが、正赤血球凝集反応は、よくの基盤上に広いシートとして表示されます。中間結果は、ペレット化した細胞の中核と陽性細胞のハローを持つことになります。血清が反応することができますが、抗体の不十分な量が全反応を引き起こすために、いくつかの抗体を持たないので、この結果が発生します。
9. 代表的な結果のセクションでは、期待される結果の2つの図式表現を持っています。結果の無効と有効なセットの例が提供されています。抗血清の力価も決定されます。

代表的な結果：

ビデオでは、代表的な結果の例が含まれています。 （Fig1および図2）の下には、図式的に示すように、2つの例です。秒が決定される力価を可能にする有効な検定のときに最初の例では、VBSの制御が正であると解釈することができる反応である。

陽性の結果が失敗した赤血球凝集の1例を図 。上記の図式表現では、heamagglutination反応が受け付けられません。 VBS血清陰性コントロールは井戸の底部にシートを形成することによって証明されるように正の赤血球凝集反応を表示します。これは、エラーが発生し、結果を受け入れることができないことを示します。このケースでは、プロセスが繰り返される。

図2。陽性の結果が正しく動作していた赤血球凝集の例。図式表現では、heamagglutination反応は有効です。 VBS陰性コントロールは陰性赤血球凝集反応が表示されますsは、井戸の基部に形成されたペレットからも明らか。最後の肯定的な井戸はこの血清サンプルの力価は128（すなわち1 / 128の逆数）であることを示す行7、です。これは、血清中の適度な量で存在する抗体の例になるであろう。

Discussion

赤血球凝集アッセイは、時間の短い期間内に評価される血清サンプルの多数を可能にするとても簡単なテクニックです。それが適している目で、特殊な装置を必要とせずに読み取られるという利点もあります。この手法はまた、赤血球凝集阻害試験の一環として、尿中のヒト絨毛性ゴナドトロピンホルモンの存在の検出のため変更することができます。標準血球凝集試験に関連して、ケアが正しく実行されるアッセイのために考慮する必要があるいくつかの領域があります。まず、このテクニックは、凹面上のセルのセトリングに基づいています。このように、それがU -または丸底マイクロタイタープレートが使用されていることが不可欠である。負と正の反応が同一の表示されるように、一般的にELISAのために使用されるように平らな底板の使用は、適切ではありません。それはまた別の血清サンプルが使用されているときに、反応性抗体は、異なる濃度で存在している可能性があることを理解すべきである。高い抗体濃度で、抗原（Revercells）が制限されることがありますし、プロゾーンの効果が観察されることがあります。これは陽性反応が最後に目撃された最後の幸福として決定されるので、しかしこれは、力価の値の決定には影響しません。最後に、この手法が定量的でない、血清中の反応性抗体の絶対水準は知られていない。ただし、ほとんどの場合これは、既知の抗原に対する反応性の判断が必要とされるすべての情報である場合は特に、必要はありません。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Revercells	CSL	02490201	Use at 1% final
Anti-A serum	CSL	02611305
96 well U bottom plate	TRP	92097	Must be U-bottom
Veronal buffered saline			Use at 1x final
37°C room/incubator
Disposable gloves