Determinação da Reatividade e Titre de soro usando um ensaio de hemaglutinação

Summary

Hemaglutinação é uma forma de aglutinação, onde anticorpos se ligam às células vermelhas do sangue. Os glóbulos vermelhos são facilmente disponíveis e os resultados são facilmente observáveis ​​a olho nu. Este vídeo mostra os passos envolvidos em um ensaio de hemaglutinação, interpretando os resultados e determinar o título.

Abstract

Hemaglutinação é uma forma específica de aglutinação e é usado quando os anticorpos se ligam a células vermelhas do sangue, que funcionam como um antígeno particulado. Os glóbulos vermelhos são alvos particularmente úteis como eles são facilmente disponíveis e de aglutinação é observável a olho nu. Esta técnica é comumente usado para determinar o título de um anticorpo (Ab), para tipagem de sangue e quantificação viral. Neste vídeo, as etapas envolvidas na preparação e realização de um ensaio de hemaglutinação é demonstrada utilizando anticorpos específicos para antígenos de grupo sanguíneo A-adicionados às células vermelhas do sangue (Revercells). O anti-soro é diluído em uma série de 96 poços de microtitulação bandeja de U-inferior, à qual é adicionada uma suspensão de Revercells. As amostras são misturados e, em seguida, incubados a 37 ° C por 60 minutos. Após este período, as amostras podem ser facilmente marcados para ve, ve + e reações de hemaglutinação intermediária (-/+). Esta abordagem permite a reatividade e título de uma amostra de soro a ser avaliados através de uma técnica rápida e simples. O vídeo irá cobrir a teoria por trás do ensaio, como os resultados são lidos e interpretados, como a determinação do título, como o ensaio pode ser modificado e problemas associados com o uso desta técnica.

Protocol

Preparação de Saline Veronal 5x Buffered (VBS)

1. Para preparar a solução salina Veronal Buffered (VBS), três soluções distintas precisa estar preparado.
2. Prepare uma solução através da dissolução de NaCl e 21.25gm 0.94gm de Barbitone de sódio em 350ml de água destilada. A concentração final das Barbitone NaCl e de sódio são 1,02 e 13mm, respectivamente.
3. Prepare a solução 2, dissolvendo 1.44gm de Barbitone em 125ml de água destilada quente. A concentração final de Barbitone é 62,5 mm.
4. Prepare a solução 3 dissolvendo 20.33gm de MgCl ₂ e 4.41gm de CaCl ₂ em 100ml de água destilada. A concentração final de MgCl ₂ e CaCl ₂ é 2.18m e 440mm, respectivamente.
5. Mix de soluções 1 e 2 e arrefecer à temperatura ambiente.
6. Uma vez que a solução combinada esfriou, adicionar 1,25 ml de solução 3 e ajustar o pH a 7,3-7,5 usando HCl 1M.
7. Ajustar o volume final de 500ml com água destilada para preparar uma solução estoque de 5x.
8. Para preparar uma solução 1x de trabalho, diluir a 1:05 estoque com água destilada.

Diluição de Revercells

1. Delicadamente ressuspender a solução estoque de Revercells por inversão e remova 1ml de células e centrifugar por 5 minutos a 600g a 4 ° C.
2. Após a centrifugação, remover cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender as células em 3 ml de 1x Veronal Buffered Saline.
3. As células podem agora ser armazenadas a 4 ° C até o uso.

Procedimento

1. Transferência de 50ml de 1x VBS em linhas A1-A12 de uma placa inferior 96 poços U.
2. Bem a A1, adicionar 50μl de soro anti-A e misture bem com uma pipeta.
3. Usando uma ponteira fresco, remover 50μl de líquido bem A1 e transferi-lo para o bem A2. Misturar bem e repetir este processo até chegar bem A11 e depois descartar a 50μl última deste bem.
4. A amostra de soro foi agora diluída em série de 2 vezes de 1:2 a 1:2048. Sem soro é adicionado ao Bem A12 como este é o controle VBS negativo.
5. Se mais de uma amostra de soro deve ser avaliada, repita os passos de 4,1-4,4 para a linha B etc
6. Uma vez que todas as diluições foram feitas, adicionar 50μl de Revercells 1% para todos os poços. Nota: O Revercells vai resolver com o tempo e deve ser suavemente suspenso antes de ser dispensado nos poços.
7. Misture as amostras batendo na lateral da bandeja de microtitulação, cubra e deixe a reação de hemaglutinação para prosseguir por 1h a 37 ° C. Uma sala de incubadora ou devidamente aquecida pode ser utilizada.
8. Após a incubação, remova cuidadosamente a bandeja da incubadora e examine a placa de hemaglutinação. O controle VBS bem deve ser o primeiro bem examinados. Se a reação for negativa, então os resultados são válidos. Se a amostra VBS mostra um resultado positivo hemaglutinação, então os resultados não podem ser utilizados eo processo deve ser repetido. A reação de hemaglutinação positiva aparecerá como uma folha larga na base do poço, enquanto que uma reação negativa aparecerá como uma pelota pequena concentração de células no centro do poço. Um resultado intermediário terá um halo de células positivas com um núcleo central de células peletizada. Este resultado ocorre como o soro tem algumas Ab que pode reagir, mas quantidades insuficientes de Ab para causar uma reação completa.
9. A seção de resultados representativos tem duas representações diagramáticas dos resultados esperados. Um exemplo de um conjunto inválido e válido de resultados é fornecido. O título do anti-soro também será determinada.

Resultados representativos:

O vídeo inclui um exemplo de resultados representativos. Abaixo (fig. 1 e Fig. 2) são dois exemplos mostrados de forma esquemática. O primeiro exemplo é de uma reação que não pode ser interpretada como o controle VBS é positivo, enquanto o segundo é um ensaio válido que permita o título a ser determinado.

Figura 1. Um exemplo de um hemaglutinação, onde o resultado positivo falhou. Na representação esquemática acima, a reação heamagglutination não pode ser aceite. O VBS soro controle negativo exibe uma reação de hemaglutinação positiva como evidenciado pela formação da folha na base do poço. Isso indica que um erro ocorreu e os resultados não podem ser aceites. Neste caso, o processo deve ser repetido.

Figura 2. Um exemplo de hemaglutinação, onde o resultado positivo tem funcionado corretamente. Na representação esquemática, a reação heamagglutination é válido. O controle negativo VBS exibe uma reação negativa hemaglutinação ums evidenciado pela pelota que se formou na base do poço. O bem é positivo última linha 7, que indica que o título para esta amostra de soro é de 128 (ou seja, o inverso de 1 / 128). Este seria um exemplo de um anticorpo que está presente em quantidades moderadas no soro.

Discussion

O ensaio de hemaglutinação é uma técnica muito simples que permite um grande número de amostras de soro para ser avaliado dentro de um curto período de tempo. Ele também tem a vantagem de ser lido sem a necessidade de equipamentos especializados, com o olho que está sendo adequado. Esta técnica também pode ser modificada para a detecção do hormônio gonadotrofina coriônica humana presentes na urina, como parte de um teste de inibição da hemaglutinação. Em relação a um teste de hemaglutinação padrão, há algumas áreas onde o cuidado deve ser tomado para que o teste seja realizado corretamente. Em primeiro lugar, esta técnica é baseada no estabelecimento de células em uma superfície côncava. Como tal, é essencial que um U ou de fundo redondo microplaca é usado. O uso de uma placa de fundo chato como é comumente usado para ELISA não é adequado, como reações negativas e positivas aparecerão idênticos. Também deve ser apreciado que, quando diferentes amostras de soro são usados, os anticorpos reativos são susceptíveis de estar presentes em concentrações diferentes. Em alta concentração de anticorpos, o antígeno (Revercells) pode ser limitante e um efeito prozona pode ser observado. No entanto, isto não afetará a determinação do valor título, já que isso é determinado como sendo o bem passado, onde uma reação positiva foi visto pela última vez. Por último, esta técnica não é quantitativa, o nível absoluto de anticorpos reativos no soro não é conhecido. No entanto, na maioria dos casos isso não é necessário, principalmente quando a determinação de reatividade a um antígeno conhecido é toda a informação que é necessária.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Revercells	CSL	02490201	Use at 1% final
Anti-A serum	CSL	02611305
96 well U bottom plate	TRP	92097	Must be U-bottom
Veronal buffered saline			Use at 1x final
37°C room/incubator
Disposable gloves