Determinazione della reattività e Titolo di siero usando un test dell'emoagglutinazione

Summary

Emoagglutinazione è una forma di agglutinazione in cui gli anticorpi si legano ai globuli rossi. Globuli rossi sono sempre disponibili ed i risultati sono facilmente osservabili ad occhio nudi. Questo video dimostra i passi coinvolti in un test di emoagglutinazione, interpretando i risultati e la determinazione del titolo.

Abstract

Emoagglutinazione è una forma specifica di agglutinazione ed è utilizzato quando gli anticorpi si legano ai globuli rossi, che agiscono come un antigene particolato. I globuli rossi sono bersagli particolarmente utili in quanto sono facilmente disponibili e agglutinazione è osservabile ad occhio nudo. Questa tecnica viene comunemente utilizzata per determinare la concentrazione di un anticorpo (Ab), per gruppo sanguigno e la quantificazione virale. In questo video, le fasi coinvolte nella preparazione e nella esecuzione di un test di emoagglutinazione è dimostrata utilizzando anticorpi specifici per gruppo sanguigno A-antigeni aggiunto ai globuli rossi (Revercells). L'antisiero è diluito in una serie ben 96 U-basso vassoio microtitre, a cui si aggiunge una sospensione di Revercells. I campioni sono miscelati e poi incubate a 37 ° C per 60 minuti. Trascorso questo tempo, i campioni possono quindi essere facilmente segnato per ve, ve + e intermedi reazioni emoagglutinazione (-/+). Questo approccio permette la reattività e titolo di un campione di siero deve essere valutato con una tecnica rapida e semplice. Il video coprirà la teoria alla base del test, come i risultati vengono letti e interpretati, come determinare il titolo, come il dosaggio può essere modificato ed eventuali problemi associati con l'uso di questa tecnica.

Protocol

Preparazione di 5x Veronal Buffered Saline (VBS)

1. Per preparare il veronal Buffered Saline (VBS), tre soluzioni separate devono essere preparati.
2. 1 Preparare la soluzione sciogliendo 21.25gm di NaCl e 0.94gm Barbitone di sodio in 350 ml di acqua distillata. Le concentrazioni finali dei Barbitone NaCl e sodio sono 1,02 e 13 mm rispettivamente.
3. Preparare la soluzione 2 sciogliendo 1.44gm di Barbitone in 125ml di acqua distillata calda. La concentrazione finale di Barbitone è 62,5 mm.
4. 3 Preparare la soluzione sciogliendo 20.33gm di MgCl ₂ e 4.41gm di CaCl ₂ in 100 ml di acqua distillata. La concentrazione finale di MgCl ₂ e CaCl ₂ è 2.18m e 440mm rispettivamente.
5. Mix di soluzioni 1 e 2 e raffreddare a temperatura ambiente.
6. Una volta che la soluzione combinata si è raffreddato, aggiungere 1,25 ml di soluzione al 3 e regolare il pH a 7,3-7,5 usando HCl 1M.
7. Regolare il volume finale di 500ml con acqua distillata per preparare una soluzione 5x magazzino.
8. Per preparare una soluzione 1x di lavoro, diluire il magazzino 1:05 con acqua distillata.

Diluizione del Revercells

1. Risospendere delicatamente la soluzione stock di Revercells per inversione e quindi rimuovere 1ml di cellule e centrifugare per 5 min a 600 g a 4 ° C.
2. Dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione il sopranatante e risospendere le cellule in 3 ml di 1x veronal Buffered Saline.
3. Le celle possono essere conservati a 4 ° C fino all'utilizzo.

Procedura

1. Trasferire 50ml di 1x VBS in righe A1-A12 di una piastra di fondo ben 96 U.
2. Per Bene A1, aggiungere 50μl di siero anti-A e mescolare accuratamente con una pipetta.
3. Utilizzando un nuovo puntale per pipetta, rimuovere 50μl di liquido dal pozzetto A1 e trasferirlo a ben A2. Agitare bene e ripetere questo processo fino a raggiungere ben A11 e poi gettare il 50μl ultimi da questo bene.
4. Il campione di siero è stato diluito in serie di 2 volte da 1:2 a 1:2048. Nessun siero viene aggiunto al Bene A12 in quanto questo è il controllo VBS negativo.
5. Se più di un campione di siero deve essere valutata, ripetere i passaggi 4,1-4,4 per riga B, ecc
6. Una volta che tutte le diluizioni sono state fatte, aggiungere 50μl di 1% Revercells a tutti i pozzetti. Nota: Il Revercells stabilirà il tempo e devono essere delicatamente sospesi prima di essere distribuiti nei pozzetti.
7. Miscelare i campioni picchiettando delicatamente sul lato del vassoio microtitolazione, coprire e lasciare la reazione di emoagglutinazione a procedere per 1h a 37 ° C. Una sala incubatore o opportunamente riscaldata può essere utilizzato.
8. Dopo l'incubazione, rimuovere con attenzione il vassoio dal termostato ed esaminare la piastra per emoagglutinante. Il controllo VBS bene dovrebbe essere il primo bene esaminato. Se la reazione è negativa, allora i risultati sono validi. Se il campione VBS evidenzia un risultato positivo emoagglutinazione, allora i risultati non possono essere utilizzati ed il processo deve essere ripetuto. Una reazione positiva emoagglutinazione apparirà come un largo foglio sul fondo del pozzo, mentre una reazione negativa apparirà come una piccola pallina di cellule concentrate nel centro del pozzo. Un risultato intermedio avrà un alone di cellule positive con un nucleo centrale di cellule pellet. Questo risultato si verifica come il siero ha qualche Ab che possono reagire, ma quantità insufficiente di Ab per provocare una reazione completa.
9. La sezione rappresentante risultati ha due rappresentazioni diagrammatiche dei risultati attesi. Un esempio di un insieme valido e valido dei risultati è fornito. Il titolo per l'anti-siero saranno anche determinati.

Rappresentante dei risultati:

Il video contiene un esempio di risultati rappresentativi. Qui di seguito (Fig. 1 e Fig. 2) sono due esempi mostrati in maniera schematica. Il primo esempio è di una reazione che non può essere interpretato come il controllo VBS è positivo, mentre il secondo è un test valido che permette il titolo da definire.

Figura 1. Un esempio di emoagglutinazione in cui il risultato positivo non è riuscito. Nella rappresentazione schematica sopra, la reazione heamagglutination non può essere accolto. Il controllo VBS siero negativo mostra una reazione positiva emoagglutinazione come dimostra la formazione del foglio alla base del pozzo. Ciò indica che un errore si è verificato ed i risultati non possono essere accettati. In questo caso, il processo deve essere ripetuto.

Figura 2. Un esempio di emoagglutinazione in cui il risultato positivo ha funzionato correttamente. Nella rappresentazione schematica, la reazione heamagglutination è valido. Il controllo VBS negativo mostra una reazione negativa emoagglutinazione unos dimostrano i pellet che si è formata alla base del pozzo. Il pozzo è positivo ultima riga 7, che indica che il titolo di questo campione di siero è 128 (ovvero il reciproco del 1 / 128). Questo sarebbe un esempio di un anticorpo che è presente in quantità moderate nel siero.

Discussion

Il saggio di emoagglutinazione è una tecnica molto semplice che permette un gran numero di campioni di siero da valutare in un breve lasso di tempo. Ha anche il vantaggio di essere letto senza la necessità di attrezzature specializzate, con l'occhio idoneo. Questa tecnica può anche essere modificato per il rilevamento di ormone umano della gonadotropina corionica presenti nelle urine, come parte di una prova di inibizione dell'emoagglutinazione. In relazione ad un test di emoagglutinazione standard, ci sono alcune aree in cui la cura deve essere presa in modo che il test deve essere eseguito correttamente. In primo luogo, questa tecnica si basa sulla risoluzione di cellule su una superficie concava. Come tale, è essenziale che un fondo a U o rotondo microtitolazione piatto viene utilizzato. L'uso di una piastra di fondo piatto come viene comunemente utilizzato per ELISA non è adatto, come reazioni negative e positive appariranno identici. Va anche apprezzato il fatto che, se diversi campioni di siero si utilizzano anticorpi reattivi sono suscettibili di essere presenti in concentrazioni differenti. Alla concentrazione anticorpale alto, l'antigene (Revercells) può essere limitante e un effetto prozona si può osservare. Tuttavia ciò non pregiudica la determinazione del valore di titolo, poiché questo è definito in base agli ultimi e in cui una reazione positiva è stata vista l'ultima volta. Infine, questa tecnica non è quantitativo, il livello assoluto di anticorpi reattivi nel siero non è noto. Tuttavia, nella maggior parte dei casi questo non è necessario, in particolare quando la determinazione della reattività di un antigene noto è tutte le informazioni necessarie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Revercells	CSL	02490201	Use at 1% final
Anti-A serum	CSL	02611305
96 well U bottom plate	TRP	92097	Must be U-bottom
Veronal buffered saline			Use at 1x final
37°C room/incubator
Disposable gloves