Haemagglutination 분석을 사용하여 혈청의 반응성 및 Titre를 결정

Summary

Haemagglutination는 항체가 적혈구에 바인딩 유착의 한 형태입니다. 적혈구가 모두 쉽게 사용할 수 있으며 그 결과는 즉시 육안을 사용하여 관찰할 수 있습니다. 이 비디오는 결과를 해석하고 titre을 결정, haemagglutination 분석에 관련된 단계를 설명합니다.

Abstract

Haemagglutination는 응집의 구체적인 형태이며, 항체가 미립자 항원의 역할을 적혈구에 바인딩할 때 사용됩니다. 적혈구들이 쉽게 사용할 수 있으므로 특히 유용 타겟하고 응집이 육안을 사용하여 관찰할 수있다. 이 기술은 일반적으로 혈액 그룹화 및 바이러스에 대한 항체 부량의 titre (AB)를 결정하는 데 사용됩니다. 이 비디오에서는 haemagglutination 분석을 준비하고 수행에 관련된 단계는 혈액형 A - 항원은 적혈구 (Revercells)에 추가 특정 항체를 사용하여 증명합니다. 항혈청는 순차적으로 Revercells의 정지를 추가하는, U - 96 잘 하단 microtitre 트레이에 희석합니다. 샘플은 60 분 동안 혼합 후 ° C 37 incubated 수 있습니다. 이 시간 후, 샘플 그때 쉽게했습니다 + 적 및 중간 (-/+)의 haemagglutination 반응에 대한 채점 수 있습니다. 이 방법은 신속하고 간단한 방법을 사용하여 평가하는 혈청 샘플의 반응과 titre을 허용합니다. 비디오 분석을 수정할 수있는 방법을 titre를 결정하는 방법 결과를 읽고 해석하는 방법 분석 뒤에 이론, 그리고이 기술의 사용과 관련된 문제를 다룰 것입니다.

Protocol

5 배 Veronal 버퍼 살린 (VBS)의 준비

1. Veronal 버퍼 살린 (VBS)를 준비하려면, 별도의 세 가지 솔루션을 준비해야합니다.
2. 증류수의 350ml에 나트륨 Barbitone의 NaCl과 0.94gm의 21.25gm을 용해하여 용액 1을 준비합니다. NaCl과 나트륨 Barbitone의 최종 농도는 각각 1.02M과 13mM 있습니다.
3. 뜨거운 증류수의 125ml에 Barbitone의 1.44gm을 용해하여 용액 2를 준비합니다. Barbitone의 최종 농도는 62.5mM입니다.
4. 증류수의 100ml에 CaCl ₂ MgCl ₂ 4.41gm의 20.33gm을 용해하여 용액 세를 준비합니다. MgCl _2, CaCl _2의 최종 농도는 각각 2.18M과 440mM입니다.
5. 믹스 솔루션 1, 2 룸 온도 냉각.
6. 통합 솔루션이 냉각되면, 솔루션 3 1.25 ML을 추가하고 1M HCL을 사용하여 7.3-7.5 수있는 산도를 조정합니다.
7. 배 재고 솔루션을 준비하는 증류수로 500ml로 최종 볼륨을 조정합니다.
8. 1X 작업 솔루션을 준비하려면, 증류수와 주식 1:5 희석.

Revercells의 희석

1. 부드럽게 전도에 의해 Revercells의 주식 솔루션을 resuspend 후 4 600g에서 5 분 세포 원심 분리기의 1ml를 제거 ° C.
2. 원심 분리 후, 조심스럽게 뜨는을 제거하고 Veronal가 살린 버퍼 1X의 3ml에있는 세포를 resuspend.
3. 세포는 이제 4 ° C까지 사용할 수 저장할 수 있습니다.

절차

1. 96 잘 U 바닥 접시의 행 A1 - A12에 1X VBS의 50ml를 전송합니다.
2. 자 A1면, 안티 - A 혈청 50μl를 추가하고 피펫을 사용하여 철저히 섞는다.
3. 신선한 피펫 팁을 사용하여, 잘 A1에서 액체의 50μl을 제거하고 잘 A2로 전송할 수 있습니다. 철저하게 혼합하고 잘 A11에 도달하고이 우물에서 마지막 50μl를 삭제 때까지이 과정을 반복합니다.
4. 혈청 샘플은 현재 순차적으로 1시 2분에서 1:2048 2 배 희석되었습니다. 이 VBS 부정적인 컨트롤로 더 혈청 잘 A12에 추가되지 않습니다.
5. 하나 이상의 혈청 샘플은 평가되어야하는 경우, 반복 행의 B 등의 4.1-4.4 단계
6. 일단 모든 dilutions가 있었고, 모든 우물 1 %의 Revercells의 50μl를 추가합니다. 참고 : Revercells 시간을 통해 해결하고 부드럽게 우물에 총동원되고 이전에 중단되어야합니다.
7. 부드럽게 microtitre 트레이의 측면을 두드리고하여 샘플을 믹스, 커버와 37 1H에 대한 진행 haemagglutination 반응 ° C.를 떠나 보육 또는 적절하게 가열 방을 사용할 수 있습니다.
8. 부화 다음, 조심스럽게 인큐베이터에서 트레이를 제거하고 haemagglutination에 대한 번호판을 검사합니다. VBS 컨트롤은 좋​​지 검사 가장 먼저해야합니다. 반응이 부정적이라면, 결과는 유효합니다. VBS 샘플은 긍정적인 haemagglutination 결과를 보여주는 경우, 결과는 사용할 수 없습니다와 과정은 반복되어야합니다. 부정적인 반응이 잘의 중앙에 세포의 작은 집중 펠렛으로 나타납니다 동안 긍정적인 haemagglutination 반응은 우물의 바닥에 넓은 시트로 표시됩니다. 중간 결과는 pelleted 세포의 중앙 코어와 함께 긍정적인 세포의 후광을 것입니다. 혈청 반응 수있는 AB를 가지고 본 결과가 발생하지만, AB의 부족한 금액은 전체 반응을 일으킬 수 있습니다.
9. 대표적인 결과 섹션 예상 결과 두 도표 표현이 있습니다. 결과의 무효와 유효 기간 설정의 예제는 제공됩니다. 백신 혈청 titre도 결정됩니다.

대표 결과 :

비디오는 대표적인 결과의 예를 포함하고 있습니다. 아래 (Fig1과 그림 2) 도표 방식에 표시된 두 예제입니다. 두 번째 결정하는 titre을 허용 유효한 분석하는 동안 첫 번째 예제는 VBS 컨트롤이 긍정적으로 해석될 수없는 반응입니다.

그림 1. haemagglutination의 예를 들어 긍정적인 결과는 실패했습니다 어디에. 위의 도표 표현에서 heamagglutination 반응은 허용되지 않습니다. VBS 혈청 부정적인 컨트롤은 물론의 기본에있는 시트 형성에 의해 입증으로 긍정적인 haemagglutination 반응을 표시합니다. 이것은 오류가 발생하고 그 결과가 수락 수 없다는 것을 나타냅니다. 이 경우 프로세스는 반복해야합니다.

그림 2. 긍정적인 결과가 올바르게 작동이 haemagglutination의 예. 도표 표현에서 heamagglutination 반응이 유효합니다. VBS 대조군은 부정적인 반응 haemagglutination에게 표시됩니다S는 우물의 바닥에 형성 하였다 펠렛에 의해 입증. 마지막으로 긍정적인 우물이 혈청 샘플에 대한 titre 128 (예 : 128분의 1의 상호)을 나타냅니다 행 7입니다. 이것은 혈청에서 적당한 금액에 존재하는 항체의 예입 것입니다.

Discussion

haemagglutination 분석 시간이 짧은 기간 내에 평가하기 위해 혈청 샘플의 수많은 수있는 아주 간단한 방법입니다. 그것은 적합한되는 눈은, 전문 장비가 필요없이 읽을되는 장점도 있습니다. 이 기술은 또한 haemagglutination - 억제 테스트의 일환으로, 소변에있는 인간 chorionic gonadotrophin 호르몬의 검출을 위해 수정할 수 있습니다. 표준 haemagglutination 테스트와 관련하여, 관리가 제대로 수행할 수있는 분석하기 위해서는 주의할 필요가 몇 가지 영역이 있습니다. 첫째,이 기법은 오목 표면에 세포의 정착에 따라 달라집니다. 따라서, 그것은 U - 또는 라운드 바텀 microtitre 플레이트를 사용하는 것이 중요합니다. 부정과 긍정적인 반응이 동일로 표시됩니다 일반적으로 엘리사에 사용되는 같은 평면 바닥 플레이트의 사용은 적합하지 않습니다. 또한 다른 혈청 샘플을 사용하는 경우, 반응 항체가 다양한 농도에 존재 가능성이있는 것으로 평가해야합니다. 높은 항체 농도에서, 항원 (Revercells)가 제한 수 있으며 prozone 효과가 관찰 수 있습니다. 이것이 긍정적인 반응이 마지막으로 목격된 마지막 웰빙으로 결정되기 때문에 그러나 이것은, titre 가치의 결정에는 영향을 미치지 않습니다. 마지막으로,이 기술은 정량 아니라, 혈청의 반응 항체의 절대 수준은 알 수 없다. 하지만, 대부분의 경우 이것은 알려진 항원에 반응의 결정이 필요한 모든 정보 특히 경우 필요하지 않습니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Revercells	CSL	02490201	Use at 1% final
Anti-A serum	CSL	02611305
96 well U bottom plate	TRP	92097	Must be U-bottom
Veronal buffered saline			Use at 1x final
37°C room/incubator
Disposable gloves