Het bepalen van de reactiviteit en de titer van Serum met behulp van een hemagglutinatie Assay

Summary

Hemagglutinatie is een vorm van agglutinatie waar antilichamen binden aan rode bloedcellen. Rode bloedcellen zijn zowel direct beschikbaar en de resultaten zijn gemakkelijk waarneembare met het blote oog. Deze video toont de stappen die betrokken zijn bij een hemagglutinatie assay, het interpreteren van de resultaten en het bepalen van de titer.

Abstract

Hemagglutinatie is een specifieke vorm van agglutinatie en wordt gebruikt wanneer antilichamen binden aan de rode bloedcellen, die fungeren als een fijn antigeen. Rode bloedcellen zijn bijzonder nuttig doelen zoals ze zijn direct beschikbaar en agglutinatie is waarneembaar met het blote oog. Deze techniek wordt vaak gebruikt om de titer van een antilichaam (Ab), voor bloedgroepen en virale kwantificering te bepalen. In deze video, is de stappen die betrokken zijn bij de voorbereiding en het uitvoeren van een hemagglutinatie assay aangetoond met behulp van antilichamen die specifiek zijn voor bloedgroep A-antigenen toegevoegd aan rode bloedcellen (Revercells). Het antiserum is serieel verdund in een 96 wells U-bodem microtiterplaten tray, waaraan is toegevoegd een suspensie van Revercells. De monsters worden gemengd en vervolgens geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 60 minuten. Na deze tijd kan de samples dan gemakkelijk worden gescoord voor ve, + ve en intermediaire (-/+) hemagglutinatie reacties. Deze aanpak maakt het mogelijk om reactiviteit en titer van een serum monster te worden beoordeeld met behulp van een snelle en eenvoudige techniek. De video zal betrekking hebben op de theorie achter de test, hoe de resultaten worden gelezen en geïnterpreteerd, hoe de titer te bepalen, hoe de test kan worden gewijzigd en alle kwesties in verband met het gebruik van deze techniek.

Protocol

De voorbereiding van 5x Veronal Buffered Saline (VBS)

1. Ter voorbereiding van de Veronal gebufferde fysiologische zoutoplossing (VBS), drie afzonderlijke oplossingen moeten worden voorbereid.
2. Maak een oplossing een door het oplossen van 21.25gm van NaCl en 0.94gm van natrium Barbitone in 350 ml gedestilleerd water. De uiteindelijke concentratie van de NaCl en Natrium Barbitone zijn 1,02 m en 13 mm respectievelijk.
3. Maak een oplossing 2 door het oplossen van 1.44gm van Barbitone in 125 ml warm gedestilleerd water. De uiteindelijke concentratie van Barbitone is 62,5 mm.
4. Bereid oplossing 3 door het oplossen van 20.33gm van MgCl ₂ en 4.41gm van CaCl ₂ in 100 ml gedestilleerd water. De uiteindelijke concentratie van MgCl ₂ en CaCl ₂ is 2,18 m en 440mm respectievelijk.
5. Mix oplossingen 1 en 2 en laat afkoelen tot kamertemperatuur.
6. Zodra de gecombineerde oplossing is afgekoeld, voeg 1,25 ml van oplossing 3 en breng de pH op 7,3-7,5 met 1M HCl.
7. Pas het uiteindelijke volume tot 500 ml met gedestilleerd water tot een 5x voorraadoplossing te bereiden.
8. Ter voorbereiding op een 1x werkende oplossing verdunnen de voorraad 01:05 met gedestilleerd water.

Verdunning van Revercells

1. Voorzichtig resuspendeer de stockoplossing van Revercells door inversie en daarna 1 ml van de cellen en centrifugeer verwijderen voor 5 min bij 600 g bij 4 ° C.
2. Na het centrifugeren, verwijder voorzichtig het supernatant en resuspendeer de cellen in 3 ml van 1x Veronal zoutoplossing.
3. De cellen kunnen nu worden opgeslagen bij 4 ° C tot gebruik.

Procedure

1. Overdracht van 50ml 1x VBS in rijen A1-A12 van een 96 goed U bodemplaat.
2. Om goed A1, voeg 50μl van serum anti-A en meng met behulp van een pipet.
3. Met behulp van een frisse pipetpunt, verwijder 50μl vloeistof uit goed A1 en overbrengen naar goed A2. Meng goed en herhaal dit proces totdat u bij goed A11 en gooi het laatste 50μl uit deze bron.
4. Het serum monster is nu in serie 2-voudig verdund van 1:2 tot 1:2048. Geen serum wordt toegevoegd aan de A12 goed want dit is de VBS negatieve controle.
5. Als er meer dan een serum monster moet worden beoordeeld, herhaalt u stap 4.1-4.4 voor rij B enz.
6. Zodra alle verdunningen zijn gemaakt, voeg 50μl van 1% Revercells aan alle putjes. Opmerking: De Revercells zal regelen in de tijd en moeten voor voorzichtig opgehangen worden aan zijn afgegeven in de putten.
7. Meng de monsters door zachtjes te tikken op de zijkant van de microtiterplaat lade, dek af en laat de hemagglutinatie reactie voor 1 uur te gaan bij 37 ° C. Een couveuse of de juiste verwarmde ruimte kan worden gebruikt.
8. Na de incubatie, verwijder voorzichtig de lade uit de incubator en onderzoekt de plaat voor hemagglutinatie. De VBS controle goed moet de eerste zijn goed onderzocht. Als de reactie negatief is, dan zijn de resultaten geldig zijn. Als de VBS voorbeeld toont een positief resultaat hemagglutinatie, dan kunnen de resultaten niet gebruikt worden en het proces moet worden herhaald. Een positieve hemagglutinatie reactie zal verschijnen als een brede plaat aan de onderkant van de put, terwijl een negatieve reactie zal zo een kleine geconcentreerde pellet van cellen in het midden van de put. Een tussentijdse resultaat zal hebben een halo van positieve cellen met een centrale kern van gepelletiseerd cellen. Dit resultaat doet zich voor als het serum heeft een aantal Ab die kunnen reageren, maar onvoldoende hoeveelheden van Ab te veroorzaken een volledige reactie.
9. De representatieve resultaten sectie heeft twee schematische voorstellingen van de verwachte resultaten. Een voorbeeld van een ongeldige en geldige set van de resultaten is voorzien. De titer van de anti-serum zal ook worden bepaald.

Representatieve resultaten:

De video bevat een voorbeeld van representatieve resultaten. Hieronder (Fig1 en figuur 2) zijn twee voorbeelden weergegeven in een schematische manier. Het eerste voorbeeld is van een reactie die niet kan worden geïnterpreteerd als de VBS-controle positief is, terwijl de tweede is een geldige test die het mogelijk maakt om de titer te bepalen.

Figuur 1. Een voorbeeld van een hemagglutinatie waar het positieve resultaat is mislukt. In de schematische weergave bovenstaande kan de heamagglutination reactie niet worden geaccepteerd. De VBS serum negatieve controle geeft een positieve reactie van hemagglutinatie zoals blijkt uit de bladvorming aan de voet van de put. Dit geeft aan dat een fout is opgetreden en de resultaten kunnen niet worden aanvaard. In dit geval moet het proces worden herhaald.

Figuur 2. Een voorbeeld van een hemagglutinatie waar het positieve resultaat correct heeft gewerkt. In de schematische weergave, de heamagglutination reactie geldig is. De VBS negatieve controle geeft een negatieve reactie van een hemagglutinaties blijkt uit de pellet die zich heeft gevormd aan de basis van de put. De laatste positieve goed is rij 7, wat aangeeft dat de titer van dit serum steekproef is 128 (dat wil zeggen de wederzijdse van 1 / 128). Dit zou een voorbeeld van een antilichaam dat aanwezig is in matige hoeveelheden in het serum worden.

Discussion

De hemagglutinatie test is een zeer eenvoudige techniek die het mogelijk maakt voor een groot aantal van de serum monsters worden beoordeeld in een korte periode van tijd. Het heeft ook het voordeel dat het lezen zonder de noodzaak voor gespecialiseerde apparatuur, met de ogen geschikt zijn. Deze techniek kan ook worden aangepast voor de detectie van humaan chorion gonadotrofine hormoon in de urine aanwezig is, als onderdeel van een hemagglutinatieremmingstest. Met betrekking tot een standaard hemagglutinatie-test, zijn er een paar gebieden waar de zorg moet worden genomen, zodat de test correct worden uitgevoerd. Ten eerste is deze techniek gebaseerd is op de afwikkeling van de cellen op een concave oppervlak. Als zodanig is het essentieel dat een U-of rondbodem microtiterplaat wordt gebruikt. Het gebruik van een vlakke bodemplaat als wordt vaak gebruikt voor ELISA is niet geschikt, als negatieve en positieve reacties zal verschijnen identiek. Ook moet duidelijk zijn dat wanneer verschillende serummonsters worden gebruikt, reactieve antilichamen zijn waarschijnlijk aanwezig te zijn bij verschillende concentraties. Bij een hoge concentratie antistoffen, kan het antigeen (Revercells) worden beperkt en een Prozone effect kan worden waargenomen. Maar dit heeft geen invloed op het bepalen van de titer waarde, omdat dit wordt bepaald als zijnde de laatste put waar een positieve reactie het laatst is gezien. Ten slotte, deze techniek niet kwantitatief is, is het absolute niveau van reactieve antilichaam in het serum niet bekend. Echter, in de meeste gevallen is dit niet nodig, vooral wanneer de bepaling van de reactiviteit van een bekende antigeen is alle informatie die nodig is.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Revercells	CSL	02490201	Use at 1% final
Anti-A serum	CSL	02611305
96 well U bottom plate	TRP	92097	Must be U-bottom
Veronal buffered saline			Use at 1x final
37°C room/incubator
Disposable gloves