التعبير عن البروتينات المؤتلف في الخميرة Methylotrophic Pichia pastoris Published: February 25, 2010 doi: 10.3791/1862

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Maria Weidner¹, Marcus Taupp¹, Steven J. Hallam¹

¹Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia - UBC

Summary

بروتوكول يصف تعبير البروتين باستخدام الخميرة methylotrophic

Abstract

بروتين تعبير في الميكروبية حقيقية النواة المضيفة pastoris Pichia توفر إمكانية توليد كميات عالية من البروتين المؤتلف في نظام التعبير سريع وسهل الاستخدام.

ك P. الكائنات الحية الدقيقة وحيدة الخلية pastoris من السهل التلاعب وتنمو بسرعة على وسائل الاعلام الرخيصة بكثافة عالية الخلية. كونه حقيقي النواة ، P. pastoris قادرة على تنفيذ العديد من التعديلات بعد متعدية التي تؤديها خلايا حقيقية النواة العالي والحصول على البروتينات المؤتلف الخضوع للطي البروتين ، وتجهيز بروتين ، ثاني كبريتيد السندات ، وتكوين ارتباط بالغليكوزيل [1].

ك P. الخميرة methylotrophic pastoris قادر على التأييض الميثانول كمصدر وحيد للكربون. وينظم بإحكام المروج قوية لأوكسيديز الكحول ، AOX1 ، والميثانول والناجمة عن استخدامه للتعبير عن الجينات في المصالح. تبعا لذلك ، يمكن أن يكون ذلك حافزا للتعبير عن البروتين الخارجية بإضافة الميثانول إلى وسط النمو [2 ، 3].

ميزة أخرى هامة هي إفراز بروتين المؤتلف في متوسطة النمو ، وذلك باستخدام تسلسل إشارة إلى استهداف بروتين الأجنبية إلى مسار إفرازية من pastoris P.. مع مستويات منخفضة من البروتين فقط يفرز الذاتية على وسائل الاعلام نفسها الخميرة والبروتينات لا تضاف إلى وسائل الإعلام ، وهو بروتين غيروي يبني غالبية البروتين الكلي في الأجلين المتوسط ​​ويسهل الخطوات التالية لتنقية البروتين [3 ، 4].

الموجه المستخدمة هنا (pPICZαA) يحتوي على مروج AOX1 لتنظيم محكم التعبير الميثانول التي يسببها ، من الجينات في المصالح ؛ إشارة إفراز α عامل لإفراز البروتين المؤتلف ، والجينات المقاومة لاختيار Zeocin في كل من E. القولونية وPichia والببتيد C - المحطة تحتوي على حاتمة ج myc وpolyhistidine (6xHis) شعارا لكشف وتنقية البروتين المؤتلف. نعرض أيضا تحليل لطخة غربية من البروتين المؤتلف باستخدام محددة لمكافحة myc - HRP الضد الاعتراف حاتمة ج myc على ناقلات الأصل.

Protocol

التعبير عن البروتينات المؤتلف في pastoris الخميرة Pichia methylotrophic

قبل البدء في هذا البروتوكول يجب أن يكون الجين اهتمامك المستنسخة في إطار في P. pastoris ناقلات الأم ، وأنها تسلسل للتأكد من التركيب الصحيح من الجينات في المصالح في النواقل.

الخطوة الأولى : توليد خلايا الخميرة electrocompetent ، الخطية للبناء والتحول إلى P. pastoris

لهذه الخطوة سوف تحتاج إلى وسائل الإعلام ولوحات التالية في متناول اليد :

• لوحات YPDS
• 600 مل المتوسطة YPD
• الجليد الباردة الماء المعقم
• 1 م السوربيتول
• Amicon الترا - 4 جهاز الطرد المركزي فلتر
• Microcon YM - 30 وحدة تصفية الطرد المركزي
• 0.2 سم electroporation كفيت
• 15 مل أنبوب زجاجي معقم
• المعقمة الماصة الزجاج باستور
• لوحات تحتوي على YPDS Zeocin

الجزء 1 : إعداد خلايا الخميرة electrocompetent

1. قبل أربعة أيام من خط التحول المقصود بها P. خلايا pastoris على طبق من ذهب من دون YPDS Zeocin والسماح لهم بزراعة 30 درجة مئوية لمدة 1-2 أيام أو حتى شكل مستعمرات واحد.
2. قبل يومين من التحول المقصود تنمو 5 مل من P. الخاص سلالة pastoris في المتوسط ​​YPD في أنبوب 50 مل الصقر عند 30 درجة مئوية خلال الليل. وضع أنبوب فالكون في قارورة لاصلاحها في شاكر.
3. قبل يوم من تلقيح 500 مل التحول المتوسطة YPD جديدة في قارورة 2 لتر مع 0.25 مل من الثقافة بين عشية وضحاها وترك ينمو مرة أخرى بين عشية وضحاها في شاكر في 30 إلى ₆₀₀ OD = 1،3-1،5 درجة مئوية.
   ملاحظة : قبل أن تضعف قوته عينتك في معمل بحيث تحصل على نتيجة دقيقة.
4. اليوم وقد تحول من الماء المثلج معقمة و 1 M السوربيتول في متناول اليد. الطرد المركزي الخلايا في 1500 XG لمدة 5 دقائق على 4 درجات مئوية. Resuspend الكرية مع 500 مليلتر من الماء والجليد الباردة العقيمة.
5. الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى الخطوة 4. Resuspend الكرية مع 250 مليلتر من الماء والجليد الباردة العقيمة.
6. الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى كما في الخطوة 4. Resuspend وبيليه في 20 مل من الجليد الباردة M 1 السوربيتول.
7. الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى كما في الخطوة 4. Resuspend الكرية في 1 مل من 1 M الجليد الباردة السوربيتول إلى الحجم النهائي من 1.5 مل ~. خلايا تخزين على الجليد أو على 4 درجات مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
   ملاحظة : نحن نستعد electrocompetent الخلايا أكثر مما يجب وتخزينها في aliquots من 80 ميكرولتر في أنابيب microcentrifuge في -80 درجة مئوية. نستخدم خلايا تخزين لمدة لا تتجاوز شهرا واحدا.

الجزء 2 : الخطية وتركيز بناء pPICZαA

يصبح خطي للتحول الموجه تحتوي على الجين الخاص الاهتمام من جانب هضم قيود. نستخدم PmeI الانزيم. تقييد مواقع أخرى ممكنة. لديك للتأكد من أن إدراج الخاص بك لا تحتوي على موقع التقييد الذي تريد استخدامه ليصبح خطي ناقلات الخاص. للتحول إلى P. pastoris ستحتاج 50-20 ميكروغرام من الحمض النووي الخطي في الماء المعقم 50-10 ميكرولتر.

يصبح خطي أيضا ، ونقل التركيز الموجه العادي (أي إدراج) في P. pastoris. الناقل الأصل دون إدراج عنصر تحكم خلفية للتعبير الخلايا ويسمح لك لتفسير نتائج التعبير.

1. أذاب كل الكواشف على الجليد ، والجمع بين الكواشف التالية وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة في الأنبوب للحصول على كل السائل إلى أسفل ، اضغط على أنبوب وتدور مرة أخرى :
   • س الماء المعقم ميكرولتر
   • 5.0 ميكرولتر 4 NEBuffer 10X
   • 0.5 ميكرولتر 100X BSA
   • لتصل إلى 2 ميكروغرام DNA ناقلات (~ 100 نانوغرام / ميكرولتر)
   • 2.0 ميكرولتر انزيم أنا مزيج PME
   → 50 ميكرولتر حجم رد الفعل الكلي
   ملاحظة : للحصول على ما يكفي من الحمض النووي ناقلات خطي تحضير مزيج أكثر من 3 أو 4 مرات في أنابيب منفصلة والجمع بين الحلول عند تركيز الحمض النووي عن طريق جهاز الهضم الترا Amicon الطرد المركزي.
2. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات وحرارة المزيج تعطيل انزيم في 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
3. في الوقت نفسه ما قبل الشطف متطرف - 4 Amicon جهاز الطرد المركزي تصفية مع 1 مل من الملة - Q المياه ، وتدور الأنبوب في 4000 x ج لمدة 6-8 دقائق وتدفق من خلال تجاهل.
   ملاحظة : لا تسمح لتجف الغشاء الرطب مرة واحدة. إذا كنت لا تستخدم الجهاز بعد قبل الشطف ، وترك المياه على الغشاء حتى يتم استخدام الجهاز.
4. الحل نقل الحرارة المعطل من الخطوة 2 إلى وحدة Amicon قبل شطفها تصفية الطرد المركزي ، وتدور الأنبوب في 4000 x ج لمدة 6-8 دقائق وتدفق من خلال تجاهل.
   ملاحظة : إذا كان لديك استعداد أكثر من مزيج الخطية ، والجمع بين جميع الحلول في واحدة وحدة تصفية Amicon الطرد المركزي.
5. أجهزة الطرد المركزي حتى يتم تخفيض المبلغ من حل على تصفية Amicon إلى 100 تقريبا 150 ~ & Mش ؛ لتر. إضافة آخر مل 1.5 من الماء المعقم في أنبوب فارغ من فوق ونقل حل للأنبوب Amicon وكرر الخطوة الطرد المركزي. يغسل مرة الثانية مع 1.5 مل من الماء المعقم وتجاهل من خلال تدفق مرة أخرى. تقليل الحجم النهائي لميكرولتر 150 ~. خطوات غسل إزالة الملح المتبقية من المنطقة العازلة لمنع تقوس عندما ينبض الخلايا.
   ملاحظة : نستخدم الدوار الدلو المتأرجح للخطوة الطرد المركزي ؛ مكان ببساطة Amicon توج الطرد المركزي وحدة التصفية في أنبوب 50 مل فالكون ليثبت في مكانه أثناء الطرد المركزي. Amicon أجهزة تصفية باستبقاء 50 ميكرولتر من حل على مرشح حتى بعد الطرد المركزي الموسعة.
6. لمزيد من تركيز الحمض النووي إعداد نقل الحمض النووي حل ما تبقى من الجهاز Amicon تصفية على Microcon قبل شطفها YM - 30 وحدة تصفية الطرد المركزي وشطف الأنبوب Amicon مع 50 ميكرولتر إضافية من الماء المعقم لاسترداد جميع الحمض النووي. أجهزة الطرد المركزي في وحدة تصفية Microcon الطرد المركزي في microcentrifuge في 10000 XG حتى لا يزال قليلا مع تغطية تصفية السائل. تدور فقط لفترة قصيرة والتحقق من كل دقيقة في حال لم يبق سوى كمية صغيرة من السائل على التصفية. الحل لاستعادة الحمض النووي ، ووضع مقلوب تتغلغل في أنبوب microcentrifuge جديدة وزيادة ونقصان في خطوة الطرد الثانية في 1000 x ج لمدة 3 دقائق. الحجم النهائي ينبغي ألا يتجاوز 10-15 ميكرولتر في المجموع ، قد يكون خلاف ذلك الحمض النووي الخاص مخففة للغاية بالنسبة للخطوة التحول.
   ملاحظة : لا تدور في جهاز تصفية طويل جدا ، ودعونا لا يجف تماما لمنع احتمال فقدان العينة. إذا كان لديك غشاء الجافة ، إضافة الماء المعقم 10-15 ميكرولتر على الغشاء ، تستنهض الهمم برفق لمدة 30 ثانية واستعادة الحمض النووي الخاص على النحو المبين أعلاه.

الجزء 3 : التحول إلى P. pastoris بواسطة electroporation

1. الحمض النووي pPICZαA خطي ومركزة تتضمن إدراج الخاص بك هو الآن على استعداد للتحول إلى P. electrocompetent خلايا pastoris (راجع الخطوة الأول ، الجزء 2). حوالي 15 دقيقة قبل التحول تحضير الكواشف والأجهزة التالية : ملء أنبوب microcentrifuge مع 1 مل من 1 M السوربيتول ووضعه على الجليد ؛ مكان electroporation الطول 0.2 كفيت على الجليد ؛ تسمية العقيمة زجاج مل 15 أنبوب ويكون معقم الزجاج ماصة باستور في متناول اليد.
2. نقل 80 ميكرولتر الخلايا من الدرجة الأولى ، الجزء 2،7 إلى 0،2 الجليد الباردة الطول كفيت electroporation. إضافة DNA تتركز pPICZαA خطي حل من الدرجة الأولى ، الجزء 3.6 و مزيج بتحريك غيض من ماصة جنبا إلى جنب لفي كفيت electroporation.
   ملاحظة : عند إضافة الحمض النووي فقط دفع ماصة إلى المحطة الأولى. بعد خلط الحمض النووي مع خلايا ماصة لدفع المحطة الثانية وإزالة ببطء من كفيت.
3. كفيت واحتضان مع الخلايا على الجليد لمدة 5 دقائق.
4. مسح خارج كفيت مع الأنسجة والخلايا نبض وفقا لمعايير الخميرة (خميرة السكيراء) على النحو المقترح من قبل الشركة المصنعة للجهاز electroporation المحددة المستخدمة.
   ملاحظة : نستخدم GenePulser بيو راد مع الشروط التالية :
   • اتهام الجهد (V) : 1500 ؛
   • السعة (μF) : 25 ؛
   • المقاومة (Ω) : 200.
   باستخدام 0.2 سم electroporation كفيت ، وبروتوكول يولد طول نبض مللي 10 ~ مع قوة ميدان ~ 7500 سم / V.
5. إضافة على الفور 1 مل من الجليد الباردة M 1 السوربيتول للكفيت. نقل المحتوى كفيت لأنبوب معقم 15 مليلتر باستخدام ماصة معقمة الزجاج باستور.
6. السماح لاحتضان أنبوب في 30 درجة مئوية دون أن تهتز لمدة 1.5 ساعة.
7. إضافة 5-7 الخرز الزجاجي المعقم على أربع لوحات YPDS المسمى تحتوي على 100 ميكروغرام / مل Zeocin. انتشار 250 ميكرولتر من مزيج electroporation من أنبوب زجاجي 15 مل في كل لوحة. يهز أفقيا لوحة موزعة بالتساوي على خلايا. السماح لوحة جافة لمدة 15 دقيقة ثم إزالة حبات من آغار التي بليت قلب.
   ملاحظة : نحن نستخدم 100 ميكروغرام / مل لتحديد Zeocin لtransformants عند استخدام سلالة Pichia GS115. قد تختلف ظروف الاختيار إذا كنت تستخدم سلالة أخرى Pichia.
8. احتضان لوحات رأسا على عقب لمدة 2 إلى 3 أيام حتى 30 درجة مئوية حتى شكل مستعمرات. التفاف على لوحات بلاستيكية سوداء في لمنع تدهور Zeocin والحساسة للضوء. أقل مبلغ يمكن أن المضادات الحيوية في لوحات نتيجة ايجابية كاذبة في الحيوانات المستنسخة.
9. وقد شكلت بعد المستعمرات ، واختيار 12 المستعمرات وتنقية لهم streaking الحيوانات المستنسخة على لوحات جديدة YPDS تحتوي على 100 ميكروغرام / مل من Zeocin.

الخطوة الثانية : التعبير عن بروتين في pastoris Pichia

لهذه الخطوة سوف تحتاج إلى أن يكون ما يلي وسائل الإعلام ، لوحات والكواشف في متناول اليد :

• BMGY المتوسطة
• الجلسرين ، تعقيمها
• BMMY المتوسطة
• والميثانول ، وتعقيمها
• EPICENTRE تنقية الحمض النووي الخميرة طقم

أنتتحتاج أيضا إلى قوارير التالية :

• قارورة 250 مل ، تعقيمها
• 1 قارورة L حيرة ، تعقيمها
• الدورق 200 مل ، تعقيمها

الجزء 1 : تعبير البروتين في pastoris Pichia

كما يتم تنفيذ كافة الخطوات التالية من أجل مكافحة ناقلات تحولت (مع عدم إدراج).

1. اختيار مستعمرة واحدة من المستعمرات Pichia تنقيته من الخطوة الأولى ، وتلقيح 3،9 جزء في BMGY 25 مل في دورق سعة 250 مل العقيمة. تنمو بمعدل 30 درجة مئوية في حاضنة تهتز (250-300 دورة في الدقيقة) حتى يصل إلى ثقافة OD ₆₀₀ = 2-6 (حوالي 16-18 ساعة).
   ملاحظة : قبل أن تضعف قوته عينتك في معمل بحيث تحصل على نتيجة دقيقة. وسوف تكون الخلايا في سجل النمو التدريجي.
2. عندما وصلت إلى الخلايا المناسبة OD ₆₀₀ إعداد المخزون الجلسرين. نقل 800 ميكرولتر من ثقافة مل الخلية من 25 إلى قارورة 2 مل كورنينج cyrogenic وإضافة 200 ميكرولتر من الجلسرين تعقيمها. تجميد الأسهم الجلسرين وتخزينها في -80 درجة مئوية.
3. الخميرة لتنقية الحمض النووي ، ونقل 1.5 مل من ثقافة مل الخلية من 25 إلى أنبوب microcentrifuge. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 1300 x ج لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وتستخدم هذه الخلايا لتحليل integrants Pichia لمضاعفة التحقق إذا كان هذا الجين في المصالح ودمجها في الجينوم Pichia (انظر الخطوة الثانية ، part2). بيليه خلية تخزين في 4 درجات مئوية حتى إجراء مزيد من التحليل.
4. نقل ما تبقى من ثقافة إلى 25 مل أنبوب 50 مل فالكون وحصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. صب طاف ووضع أنابيب رأسا على عقب على منديل ورقي لإزالة أي وسائط المتبقية. لغسل خلايا resuspend بيليه في 20 مل BMMY لإزالة أي وسيط BMGY الباقين ، والجلسرين من المتوسط ​​يمكن أن تمنع BMGY التعبير في وقت لاحق. الطرد المركزي مرة أخرى في 3000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وسكب وطاف.
5. Resuspend الخلية بيليه إلى OD ₆₀₀ من 1.0 في المتوسط ​​BMMY للحث على التعبير (حوالي 100-200 مل) ، ونقل الثقافة في قارورة 1 لتر حيرة. غطاء القارورة مع كوب 200 مل والعودة إلى الحاضنة لمواصلة النمو حتى 30 درجة مئوية.
   ملاحظة : من المهم أن درجة حرارة لا تزيد عن 30 درجة مئوية. إذا كانت درجة حرارة الحاضنة يتقلب الخاص ، تعيين درجة الحرارة عند 28 درجة مئوية. التهوية المناسبة أيضا معلمة هامة للتعبير عن كفاءة خلال تحريض الميثانول (عندما حمل التعبير ، لم يتجاوز حجم ثقافة> 10-30 ٪ من حجم الخاصة بك قارورة المجموع). نحن نوصي بشدة استخدام قوارير حيرة ، لأنها أعرض المزيد من الأوكسجين في وسائل الإعلام الثقافة.
6. إضافة الميثانول النقي المعقم إلى تركيز النهائي من الميثانول 0.5 ٪ كل 24 ساعة للحفاظ على الاستقراء.
7. في نقطة زمنية معينة بعد بدء التعبير 1 مل نقل الثقافة إلى أنبوب مل microcentrifuge 1.5. الطرد المركزي في 1300 مقابل 2.5 XG دقيقة في درجة حرارة الغرفة. طاف لنقل منفصلة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. تخزين العلف وطاف في الخلية حتى -80 درجة مئوية إلى مزيد من التحليل. وسيتم تحليل عينات من نقاط زمنية مختلفة لتحديد الفترة الزمنية المثلى للتعبير البروتين بعد الاستقراء.
   ملاحظة : نختار 6H ، 12H ، 24H ، 36h 48h وكما يشير الوقت لأخذ العينات. مزيد من النمو تصل إلى 4 أيام هو ممكن. النقاط الوقت الأمثل تختلف بين مختلف البروتينات التي أعرب عنها.
8. تحليل supernatants وكريات خلية للتعبير البروتين Coomassie الملطخة SDS - PAGE والغربية وصمة عار (وليس وصفها في هذا البروتوكول).

الجزء 2 : الخميرة تنقية الحمض النووي وتحليل PCR لintegrant Pichia

يتم تضمين كافة الكواشف اللازمة لتنقية خطوة الخميرة الحمض النووي للثقافة في Pichia BMGY في أدوات الخميرة MasterPure تنقية الحمض النووي من EPICENTRE.
ملاحظة : هذا التحليل إضافية ويتم تنفيذه لتحديد ما إذا كانت الجينات في المصالح ودمجها في الجينوم Pichia. وتستخدم الخلية بيليه من عينة أخذت من 1.5 مل الثقافة في BMGY (انظر الخطوة الثانية ، الجزء 1.3).

اتبع تعليمات من الخميرة MasterPure Epicentre دليل تنقية الحمض النووي وتشغيل PCR مع الحمض النووي الخميرة مع الاشعال محددة للإدراج. تحليل 3 ميكرولتر من المنتج PCR على agarose هلام يحتوي على 1 بروميد إيثيديوم ميكرولتر. وتشمل (أ) 1 ⁺ كيلو بايت حجم علامة في بئر واحدة لتفسير حجم إدراج الخاص بك وتصور باستخدام الحمض النووي لمحطة الوثائق هلام.

ويمكن تحليل هذا البروتين المؤتلف من خلال تحليل لطخة غربية. لا يمكن أن يؤديها تنقية البروتين تنقية صاحب العلامة على الراتنج ، المعادن المشحونة (وليس وصفها في هذا البروتوكول).

التذييل ، وقائمة الوصفات

الخطوة الأولى :

1. YPD المتوسط ​​:
   لتحضير 600 ملمتوسطة YPD (خميرة متوسطة مستخلصات العنب ببتون) تذوب الخميرة استخراج 5 و 12 ز ز ببتون في 540 مليلتر من الماء. الأوتوكلاف لمدة 20 دقيقة في دورة السائل.
   في الوقت نفسه تعد 70 مل من سكر العنب 20 ٪ وقبل استخدام فلتر تعقيم.
   اسمحوا الحل تعقيمها باردة ل~ 60 درجة مئوية ، وإضافة 60 مل من فلتر تعقيم دكستروز 20 ٪.
2. YPDS (+ Zeocin) لوحات :
   لتحضير 500 مل من YPDS + Zeocin أغار (الخميرة متوسطة مستخلصات العنب ببتون مع السوربيتول) تذوب الخميرة استخراج 5 ز ، ز 91.1 ز ببتون السوربيتول و 10 في 450 مليلتر من الماء. إضافة 10 غراما من أجار وشريط مغناطيسي وجهاز التعقيم لمدة 20 دقيقة في دورة السائل.
   في الوقت نفسه تعد 60 مل من سكر العنب 20 ٪ وقبل استخدام فلتر تعقيم.
   اسمحوا الحل تعقيمها باردة ل~ 60 درجة مئوية ، بإضافة 50 مل من فلتر تعقيم دكستروز 20 ٪.
   صب لوحات قليلة قبل إضافة المضادات الحيوية لوحات YPDS دون Zeocin. ثم يضاف 500 Zeocin ميكرولتر من 100 ملغ / مل حل الأسهم للحصول على التركيز النهائي للZeocin ميكروغرام / 100 مل في أجار. اسمحوا تحريك مغناطيسي على طبق من ذهب عند إضافة المضادات الحيوية والسماح للضجة حول دقيقة 2 إضافية لمزيج بالتساوي.
   صب سائل الإعلام في أطباق بتري ، وتغطي مع البلاستيك الأسود. السماح لوحات الجافة على مقاعد البدلاء بين عشية وضحاها. لوحات تحتوي على مخزن YPD Zeocin في 4 درجات مئوية. العمر الافتراضي هو واحد إلى أسبوعين.
   ملاحظة : مع تغطية البلاستيك ضروري لأن Zeocin حساس الضوء.

الخطوة الثانية :

1. BMGY (التخزين المؤقت الجلسرين المركب متوسطة) وBMMY (التخزين المؤقت للميثانول المعقدة متوسطة) :
   حل لكل 8 ز المتوسطة من خلاصة الخميرة و 16 ز ببتون في 560 مل من الماء. الأوتوكلاف لمدة 20 دقيقة في دورة السائل.
   في الوقت نفسه اعداد الحلول التالية :
   • 1 فوسفات البوتاسيوم M العازلة ، 6.0 درجة الحموضة :
   الجمع بين 24 مل من 1M هبو ₂ K ₄ و 156 مل من 1M هبو ₂ K ₄ و تؤكد أن الرقم الهيدروجيني = 6.0 (إذا كان الرقم الهيدروجيني بحاجة إلى تعديل ، واستخدام حامض الفوسفوريك أو KOH). فلتر تعقيم وتخزين في درجة حرارة الغرفة. العمر الافتراضي لهذا الحل هو أكبر من سنة واحدة.
   • 10X YNB (13.4 ٪ نيتروجين قاعدة الخميرة مع سلفات الأمونيوم دون الأحماض الأمينية) :
   حل 26،8 غراما من قاعدة النيتروجين الخميرة (YNB) مع سلفات الأمونيوم وبدون الأحماض الأمينية في 200 مليلتر من الماء وتصفيته تعقيم. الحرارة الحل بحل YNB تماما في الماء. المحل في 4 درجات مئوية. العمر الافتراضي لهذا الحل هو ما يقرب من سنة واحدة. ملاحظة : بدلا من ذلك ، استخدم 3.4 غرام من دون YNB كبريتات الامونيوم والأحماض الأمينية ودون إضافة 10 غرام من كبريتات الامونيوم.
   • 500X B (0.02 ٪ البيوتين) :
   حل 10 ملغ البيوتين في 50 مل من الماء وتصفيته تعقيم. المحل في 4 درجات مئوية. العمر الافتراضي لهذا الحل هو ما يقرب من سنة واحدة.
   • 10X M (5 ٪ الميثانول) :
   مزيج 5 مل من الميثانول مع 95 مليلتر من الماء. تصفية وتعقيم المحل في 4 درجات مئوية. العمر الافتراضي لهذا الحل هو ما يقرب من شهرين.
   • 10X غراي (10 ٪ الجلسرين) :
   مزيج 10 مل من الجلسرين مع 90 مليلتر من الماء. فلتر تعقيم. تخزين في درجة حرارة الغرفة. العمر الافتراضي لهذا الحل هو أكبر من سنة واحدة.
   اسمحوا الحل تعقيمها باردة لدرجة حرارة الغرفة ، ثم إضافة ما يلي وتخلط جيدا :
   • 80 مل من البوتاسيوم 1 م العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 6.0 ؛
   • YNB 10X 80 مل
   • 0.16 مل B 500X
   • 80 مل غراي 10X
   لإعداد BMMY ، إضافة مل 10X 80 م بدلا من الجلسرين.
   تخزين وسائل الاعلام في 4 درجات مئوية. العمر الافتراضي لهذا الحل هو ما يقرب من شهرين.

ممثل النتائج

الشكل 1 ، وهذا يظهر صورة لطخة غربية أعربت عن أربعة بروتينات (وصفت بانها 1605 ، 0537 ، 1228 ، و 1682) بعد 24 ساعة من التعبير. كانت تستخدم لالضد immunoblotting وهو جسم C - myc - HRP. الممر الثاني (المسمى N) هو السيطرة السلبية وكان محملا طاف من الخلايا التي لا تعبر عن البروتين المؤتلف بسبب تحويلها مع الوالد (عادي) النواقل.

Discussion

يوصف التعبير البروتين باستخدام الخميرة Pichia methylotrophic pastoris كنظام المضيف في هذا البروتوكول. يمكن أن يفرز هذا البروتين في المتوسط ​​اعتمادا على ناقلات الاستنساخ المستخدمة. إفراز بروتين المؤتلف يجعل تنقية اللاحقة أسهل. ومع ذلك ، قد أظهرت الظروف أن يكون الأمثل للتعبير عن مختلف البروتينات والتغيرات في الظروف والأوقات التعبير قد يؤدي إلى زيادة في مستويات البروتين. الموجه المستخدمة في هذا البروتوكول لديه ميزة لحاتمة ج myc والضد لهذا يمكن شراؤها حاتمة. هذا يسمح تحليل البروتينات التي لا توجد أضداد متاحة بعد. ميزة له ، سمة من ناقلات الأم يسهل عملية تنقية البروتين على المعادن شيلاتينغ الراتنج وهناك أيضا الأجسام المضادة لهذا الباب له ، سمة من ناقلات المتاحة.

كما هو موضح في هذا البروتوكول ، والتعبير البروتين في pastoris Pichia هو عملية متعددة الخطوات ، التي تحتاج إلى تخطيط جيد واستعداد. مطلوب من الوقت أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع لتنفيذ جميع الخطوات ولكن مع استبعاد استنساخ للبناء مع الجينات في المصالح. الأساس للتحول الناجح في P. pastoris وكفاءة عالية تحول خلايا الخميرة المختصة وبناء خطي التي يمكن أن تندمج في الجينوم الخميرة. الغربية لطخة تحليل وتنقية صاحب العلامة ، هي تطبيقات لتحديد مستوى البروتين المؤتلف والتعبير هي الخطوات المقبلة لتنفيذ هذا البروتوكول بعد.