Summary
프로토콜은 methylotrophic 누룩을 사용하여 단백질 발현을 설명합니다
Abstract
미생물 진핵 숙주 Pichia pastoris에서 단백질의 표현은 빠르고 사용하기 쉬운 표현 시스템에서 재조합 단백질의 높은 금액을 생성할 수있는 가능성을 제공합니다.
단세포 미생물로서 P. pastoris는 조작하기 쉬운 높은 세포 밀도에서 저렴한 미디어에 빠르게 자랍니다. 진핵세포 생물, P. 웰빙 pastoris 높은 진핵 세포 얻은 재조합 단백질에 의해 수행 사후 translational 수정의 많은 단백질 접힘, proteolytic 처리, 이황화 결합 형성과 글리코 실화 [1]를 받아야 수행할 수 있습니다.
methylotrophic 효모 P.으로 pastoris는 유일한 탄소 소스로 메탄올을 metabolizing이 가능합니다. 알코올 산화 효소, AOX1에 대한 강력한 발기인은 밀접하게 규제와 메탄올에 의해 유도하고 그것은 관심의 유전자의 표현에 사용된다. 따라서, 외국 단백질의 표현은 성장 매체 메탄올을 추가하여 유도된 수있다 [2, 3].
또 다른 중요한 장점은 P. pastoris의의 분비 경로로 외국 단백질을 대상으로 신호 시퀀스를 사용하여 성장 매체로 재조합 단백질의 분비이다. 효모 자체로 미디어에 분비 내생 단백질과 언론 노 추가 단백질만을 낮은 수준, heterologous 단백질은 매체에있는 총 단백질의 대부분을 빌드하고 단백질 정화 단계에 따라 용이하게 [3, 4].
재조합 단백질, E. 모두 선택할 Zeocin 저항 유전자의 분비에 대한 α - 계수 분비 신호, 여기에 사용되는 벡터는 (pPICZαA) 관심있는 유전자의 꽉 규제, 메탄올 유도된 표현 AOX1 발기인을 포함 대장균과 Pichia 및 C - myc 에피토프 및 재조합 단백질의 감지 및 정화를위한 polyhistidine (6xHis) 태그를 포함하는 C - 말단 펩타이드. 우리는 또한 부모 벡터의 C - myc의 에피토프을 인식하는 특정 안티 - myc - HRP 항체를 사용하여 재조합 단백질의 서양 얼룩 분석을 보여줍니다.
Protocol
methylotrophic 효모 Pichia pastoris의 재조합 단백질의 표현
이 프로토콜을 시작하기 전에 당신은 P.의 프레임에 복제된 관심의 유전자가 있어야 그것은 벡터에 대한 관심의 유전자의 정확한 삽입 확인하는 pastoris의 부모 벡터 및 합성있다.
단계 I : P.으로 구조 변화의 선형화을 electrocompetent 효모 세포를 생성 pastoris
이 단계에서 여러분은 손에에서 다음 미디어 접시가 필요합니다
- YPDS 플레이트
- 600 ML YPD 매체
- 얼음처럼 차가운 물 살균
- sorbitol 1 M
- Amicon 울트라 - 4 원심 필터 장치
- Microcon YM - 30 원심 필터 유니트
- 0.2 cm electroporation 쿠베트
- 15 ML 무균 유리관
- 멸균 유리 파스퇴르 피펫
- Zeocin을 포함 YPDS 플레이트
1 부 : electrocompetent 효모 세포의 준비
- 4 일 전에 P. 밖으로 의도 변형 스트 리크 pastoris의 Zeocin없이 YPDS 접시에 세포들이 1-2 일 동안 또는 하나의 식민지 양식까지 30 ° C를 성장하자.
- 의도된 변형 이틀 전에는 P. 5 ML 성장 30 50 ML 팰컨 튜브 YPD 매체 pastoris 스트레인 ° C 하룻밤. 통에 문제를 해결하기 위해 플라스크에 팰컨 튜브를 놓습니다.
- 0.25 밤새 문화의 ML과 30 통에 밤새 다시 기르 ° C를 OD 600 = 1.3-1.5 함께 2리터 플라스크에 신선한 YPD 매체의 변환 예방 500 ML 전날.
참고 : 정확한 결과를 얻을 수 있도록 분광 광도계에 측정하기 전에 샘플을 희석. - 변화의 하루 얼음처럼 차가운 살균 물 가까이에 1 M sorbitol 있습니다. 4 5 분 1,500 XG에서 세포를 원심 ° C. 얼음처럼 차가운, 멸균 물 500 ML와 펠렛을 Resuspend.
- 4 단계로 다시 세포를 원심 분리기. 얼음처럼 차가운, 멸균 물 250 ML와 펠렛을 Resuspend.
- 4 단계에서와 같이 다시 세포를 원심 분리기. sorbitol 얼음처럼 차가운 1 M 20 ML에서 펠렛을 Resuspend.
- 4 단계에서와 같이 다시 세포를 원심 분리기. ~ 1.5 ML의 최종 볼륨 sorbitol 얼음처럼 차가운 1 M 1 ML에서 펠렛을 Resuspend. 얼음이나 4 ° C 이상 사용할 때까지 보관 세포.
참고 : 우리가 필요 이상 electrocompetent 세포를 준비하고 -80에서 microcentrifuge 튜브 80 μl의 aliquots에 저장 ° C. 우리는 한 달 이상 더 이상에 대한 저장된 세포를 사용합니다.
2 부 : 선형화 및 pPICZαA 구조의 농도
변형에 대한 제한은 소화에 의해 관심의 유전자를 포함하는 벡터를 linearize. 우리는 효소 PmeI를 사용합니다. 기타 제한 사이트 가능합니다. 당신은 삽입은 당신의 벡터를 linearize하는 데 사용하려는 제한 사이트를 포함하지 않도록해야합니다. P.로 변환 pastoris은 5-10 μl 멸균 물 속에 선형 DNA의 5-20 μg 필요합니다.
또한, linearize 집중 P.으로 일반 벡터 (NO 삽입)를 전송 pastoris. 삽입하지 않고 부모 벡터 배경 세포 표현 통제하고 당신의 표현의 결과를 해석 할 수 있습니다.
- 얼음의 모든 시약을 녹여 다음 시약을 결합하고 간략하게, 하단에 모든 액체를 얻을 수있는 튜브를 원심 튜브를 누르고 다시 스핀 :
- X μl 멸균 물
- 5.0 μl 10X NEBuffer 4
- 0.5 μl 100X BSA
- 최대 2 μg 벡터 DNA (~ 100 NG / μl)로
- 2.0 μl PME I 효소 믹스
참고 : 별도의 튜브에 위의 조합에게 3 또는 4 번 준비하고 Amicon 울트라 원심 장치를 통해 소화 DNA를 집중하면 솔루션을 결합하여 충분한 선형 벡터 DNA를 얻을 수 있습니다. - 3 시간 열을 20 분 65 ° C에서 효소 믹스를 inactivate ° C가 37 알을 품다.
- 그 동안, 밀리 Q 물 1 ML과 Amicon 울트라 - 4 원심 필터 장치를 미리 씻어 6~8분 위해 4000 XG에서 튜브를 회전하고 흐름을 통해 폐기하십시오.
참고 : 멤브레인 한 번 서부 유럽 표준시를 건조하는 것을 허용하지 않습니다. 사전 rinsing 후 장치를 사용하지 않는 경우 장치가 사용되는 때까지 멤브레인 물을 두십시오. - 미리 씻어서 Amicon 원심 필터 유니트에 2 단계의 열 inactivated 솔루션을 전송, 6-8 분 동안 4,000 XG에서 튜브를 돌려서을 통해 흐름을 폐기.
참고 : 하나 이상의 선형화 믹스를 준비하는 경우, 하나 Amicon 원심 필터 단위로 모든 솔루션을 결합하여. - Amicon 필터 솔루션의 금액이 약 100 감소 때까지 원심 분리기 ~ 150 & mU; 나 위에서 빈 관에 멸균 물의 또 다른 1.5 ML를 추가하고 Amicon 튜브에 대한 해결책을 전송하고 원심 분리 단계를 반복합니다. 멸균 물의 1.5 ML로 두 번째 시간을 씻고 다시 통해 흐름을 폐기. ~ 150 μl에 최종 볼륨을 줄입니다. 세척 단계는 세포를 pulsing 때 arching 방지하기 위해 버퍼의 남은 소금을 제거합니다.
참고 : 우리가 원심 분리 단계를위한 스윙 버킷 로터를 사용하여, 간단히 원심 분리하는 동안 제자리에 고정하기 위해 50 ML 팔콘 튜브에 뒤덮힌 Amicon 원심 필터 장치를 놓으십시오. Amicon 필터 장치도 확장 원심 분리 후 필터에 솔루션을 50 μl를 유지합니다. - DNA 준비가 더 집중을 위해 미리 씻어서 Microcon YM - 30 원심 필터 유닛에 Amicon 필터 장치에서 남아있는 DNA 솔루션을 전송하고 모든 DNA를 복구하기 위해 멸균 물의 추가 50 μl로 Amicon 튜브를 헹굴. 필터가 여전히 약간 액체로 덮여 있습니다까지 10,000 XG에 microcentrifuge에 Microcon 원심 필터 유닛을 원심 분리기. 단지 짧은 시간 동안 회전 및 액체의 단지 소량이 필터에 남아있다면 매 순간을 확인하십시오. 당신의 DNA 솔루션을 복구하려면 3 분 1,000 XG에서 두 번째 원심 분리 단계에서 새로운 microcentrifuge 튜브와 스핀에서 필터 거꾸로 내려 놓으십시오. 최종 볼륨 총 10-15 μl을 초과하지 말아야하고, 그렇지 않으면 당신의 DNA는 너무 변환 단계에 희석 수 있습니다.
참고 : 너무 오래 필터 장치를 회전하고 잠재적인 샘플 손실을 방지하기 위해 완전히 건조되지 않도록하십시오. 귀하의 멤브레인가 건조되면, 멤브레인에 10-15 μl 멸균 물을 추가 30 초 동안 부드럽게 선동하고 위에 설명된대로 귀하의 DNA를 복구합니다.
파트 3 : P.로 변환 electroporation에 의해 pastoris
- 사용자 삽입을 포함하는 선형과 집중 pPICZαA의 DNA는 이제 electrocompetent P.으로 변환을위한 준비 pastoris 세포 (단계 I, 2 부 참조). 장소 얼음에 0.2 cm의 electroporation의 쿠베트,, sorbitol 1 M 1 ML있는 microcentrifuge 관을 기입하여 얼음에 배치 레이블 살균 15 ML 유리관과 살균을 : 변환하기 전에 약 15 분 다음과 같은 시약 및 장치를 준비 손을 유리 파스퇴르 피펫.
- 얼음처럼 차가운 0.2 cm의 electroporation의 쿠베트 단계 I, 일부 2.7에서 세포의 80 μl을 전송합니다. electroporation의 쿠베트에서 사이드 - 투 - 측면에서 피펫 팁을 이동하여 단계 I, 일부 3.6과 혼합에서 집중 선형 pPICZαA의 DNA 솔루션을 추가합니다.
참고 : DNA를 추가하면 첫 번째 막을 피펫 밀어 때. 로 DNA를 혼합 후 세포가 두 번째 막을 피펫을 누르면 천천히 쿠베트에서 제거합니다. - 5 분 얼음 세포와 쿠베트을 품어.
- 휴지로 쿠베트의 바깥쪽을 닦으과 같이 사용중인 특정 electroporation 장치의 제조 업체가 제안 효모 (Saccharomyces cerevisiae의) 대한 매개 변수에 따라 전지를 펄스.
참고 : 우리가 다음 조건을 가진 바이오 - 래드 GenePulser를 사용- 전압 (V) 충전 : 1500을;
- 용량 (μF) : 25;
- 저항 (Ω) : 200.
- 즉시 쿠베트에 sorbitol 얼음처럼 차가운 1 M 1 ML를 추가합니다. 멸균 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 살균 15 ML 튜브에 쿠베트 내용을 전송합니다.
- 1.5 시간 동안 흔들림없이 30 ° C에서 튜브 부화하자.
- 100 μg / ML의 Zeocin를 포함하는 네 표시 YPDS 플레이트에 5-7 소독 유리 구슬을 추가합니다. 각 접시에 15 ML 유리관에서 electroporation 믹스 250 μl을 확산. 수평으로 고르게 세포를 확산 판 흔들어. 접시가 15 분 동안 건조 후 반전 접시로 한천에서 비즈를 제거하자.
참고 : GS115 Pichia의 변형을 사용할 때 우리가 transformants을 선택 ~ 100 μg / ML Zeocin을 사용합니다. 다른 Pichia의 변형을 사용하는 경우 선택 조건은 다를 수 있습니다. - 식민지 양식까지 30 2~3일 ° C에 대해 거꾸로 번호판을 품어. 빛을 민감한 Zeocin의 저하를 방지하기 위해 검은 플라스틱 접시를 넣어. 접시에 항생제 적은 금액은 잘못된 긍정적인 클론이 발생할 수 있습니다.
- 식민지가 형성 후, 12 식민지를 선택 100 μg / Zeocin의 ML를 포함하는 신선한 YPDS 접시에 클론을 줄이하여 정화.
단계 II : Pichia pastoris에서 단백질의 발현
이 단계에서 여러분은 손에에서 다음 미디어, 접시와 시약이 필요합니다 :
- BMGY 매체
- 글리세롤, 멸균
- BMMY 매체
- 메탄올, 멸균
- EPICENTRE 효모의 DNA 정제 키트
너또한 다음 flasks 필요합니다
- 250 ML 플라스크는 autoclaved
- 1 L 당황하게 술병, autoclaved
- autoclaved 200 ML 비커,
1 부 : Pichia pastoris에서 단백질의 발현
다음 단계의 모든도 변형 제어 벡터 (NO 삽입 포함)에 대해 수행됩니다.
- 단계 I, 일부 3.9에서 정화 Pichia의 식민지에서 하나의 식민지를 선택하고 살균 250 ML 플라스크 25 ML의 BMGY에 접종. 30 · 문화까지 흔들어 인큐베이터 (250-300 RPM)에서 C는 OD 600에 도달 = 2-6 (약 16~18시간.) 성장
참고 : 정확한 결과를 얻을 수 있도록 분광 광도계에 측정하기 전에 샘플을 희석. 세포는 로그 위상 성장 것입니다. - 세포는 글리세롤 주식을 준비 적절한 OD 600에 도달했습니다 때. 2 ML 코닝 cyrogenic 유리병에 25 ML의 세포 배양 800 μl를 전송하고 소독 글리세롤 200 μl를 추가합니다. -80에서 글리세롤 주식과 상점을 고정 ° C.
- 효모 DNA 정화 들어, microcentrifuge 관에 25 ML 셀 문화의 1.5 ML를 전송합니다. 실온에서 1 분 1,300 XG에 centrifuging하여 세포를 수확. 이러한 세포는 관심의 유전자가 Pichia의 게놈 (단계 II, 파트 2 참조)에 통합이있다면 두 번 확인 Pichia의 integrants을 분석하는 데 사용됩니다. 4 세포 펠렛을 저장 ° C 자세한 분석까지.
- 50 ML 팔콘 튜브에 25 ML 문화의 나머지를 전송하고 실온에서 5 분 3,000 XG에 centrifuging하여 세포를 수확. 가만히 따르다의 뜨는 및 잔류 미디어를 제거하는 거꾸로 조직에 튜브를 놓으십시오. 세포를 씻어 펠렛은 남아있는 BMGY 매체를 제거 BMGY 매체에서 글리세롤로 나중에 표현을 억제은 20 ML의 BMMY에 resuspend. 상온에서 5 분 3,000 XG에서 다시 원심 분리기 및 뜨는을 가만히 따르다.
- BMMY 매체 1.0 OD 600 Resuspend 세포 펠렛은 표현을 유발 (약 100-200 ML)과 1리터 실패하는 술병의 문화를 전송할 수 있습니다. 200 ML의 비커와 술병을 차지하고 있으며 30 성장을 계속 인큐베이터로 돌아가 ° C.
참고 : 온도 30를 초과하지 않는 것이 중요합니다 ° C. 귀하의 인큐베이터의 변동의 온도가 28에서 온도를 설정하면 ° C. 적절한 통기도 메탄올 유도 기간 동안 효율적인 표현을위한 중요한 매개 변수 (표현을 유도하면, 문화 볼륨> 총 플라스크 볼륨의 10-30%을 초과하지 않습니다)입니다. 그들은 문화 미디어에 더 많은 산소를 소개로 우리는 매우, 실패하는 flasks의 사용을 권장합니다. - 유도를 유지하기 위해 24 시간마다 0.5 %의 메탄올을 최종 농도로 소독 순수한 메탄올을 추가합니다.
- 1.5 ML의 microcentrifuge 관으로 문화의 표현 전송 1 ML의 시작 이후 일정 시간이 지점에서. 상온에서 2.5 분 1,300 XG에 원심 분리기. 별도의 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 뜨는를 전송합니다. 자세한 분석까지 -80에서 뜨는 및 세포 펠렛 ° C에 보관하십시오. 다른 시간 지점에서 샘플 유도 후 단백질 표현을위한 최적의 기간을 설정하는 분석됩니다.
참고 : 우리가 샘플을 채취를위한 시간을 포인트로 6h, 12h, 24, 36h와 48h를 선택합니다. 최대 4 일 추가 성장이 가능합니다. 최적의 시간을 가리키는 다른 표현 단백질 사이에 다릅니다. - 쿠매시 묻은 SDS - PAGE과 서양 얼룩 (이 프로토콜에서 설명되지 않음)에 의해 단백질의 표현에 대한 supernatants과 셀 알약을 분석합니다.
2 부 : 효모의 DNA 정화와 Pichia의 필요 불가결의 PCR 분석
BMGY에 Pichia 문화의 효모 DNA 정화 단계에 필요한 모든 시약은 EPICENTRE에서 MasterPure의 효모의 DNA 정제 키트에 포함되어 있습니다.
참고 :이 분석을 추가하고 관심의 유전자가 Pichia의 게놈에 통합되었는지 확인하기 위해 수행됩니다. BMGY의 문화 (단계 II, 일부 1.3 참조)에서 촬영한 1.5 ML 샘플에서 세포 펠렛이 사용됩니다.
Epicentre MasterPure의 효모의 DNA 정제 설명서의 지시에 따라 삽입 특정 primers과 효모 DNA와 PCR을 실행합니다. 1 μl ethidium의 브로마이드가 포함된 아가로 오스 겔에 PCR 제품의 3 μl를 분석합니다. 사용자 삽입의 크기를 해석하고 젤 문서 스테이션을 사용하여 DNA를 시각화하는 잘 하나에서 1 KB + 사이즈 마커를 포함합니다.
재조합 단백질은 서양 얼룩 분석에 의해 분석하실 수 있습니다. 단백질 정제는 금속 충전 수지 (이 프로토콜에서 설명되지 않음)에 대한 그의 태그 정화하여 수행할 수 있습니다.
부록, 요리법 목록
단계 I :
- YPD 매체 :
600 ML를 준비하려면YPD 매체 (효모 추출 펩톤 덱스 트로 오스 미디엄) 물 540 ML에 5g 효모 추출물 및 12g 펩톤을 풀다. 액체 사이클 20 분 압력솥.
그 동안 20 %의 덱스 트로 오스 및 사용하기 전에 필터 - 소독의 70 ML을 준비합니다.
~ 60 autoclaved 솔루션은 식지 ° C 및 필터 - 소독 20 %의 덱스 트로 오스의 60 ML를 추가합니다. - YPDS (+ Zeocin) 접시 :
YPDS 500 ML + Zeocin의 한천을 (Sorbitol와 효모 추출 펩톤 덱스 트로 오스 미디엄) 5g 효모 추출물, 물 450 ML에 91.1 g sorbitol과 10g의 펩톤를 해산 준비합니다. 10 한천의 g와 액체의 생리주기에 20 분 동안 자기 저어 바와 압력솥을 추가합니다.
그 동안 20 %의 덱스 트로 오스 및 사용하기 전에 필터 - 소독의 60 ML을 준비합니다.
~ 60 autoclaved 솔루션은 식지 ° C, 필터 살균 20 %의 덱스 트로 오스의 50 ML를 추가합니다.
Zeocin없이 YPDS 접시에 대한 항생제를 추가하기 전에 몇 가지 번호판을 하거라. 다음 한천 100 μg / ML Zeocin의 최종 농도를 얻기 위해 100 MG / ML 주식 솔루션에서 500 μl Zeocin를 추가합니다. 항생제를 추가할 때 자기 접시에 저어와 마찬가지로 혼합에 추가 이분 약 저어하자.
배양 접시에 미디어를 붓고, 검정 비닐 커버. 하룻밤 벤치에 플레이트를 건조하자. 4 Zeocin를 포함하는 저장 YPD 접시 ° C. 수명은 1~2주입니다.
참고 : Zeocin 빛을 민감한 있기 때문에 플라스틱과 보험이 필요합니다.
II 단계 :
- BMGY (버퍼 글리세롤 - 복합 매체)와 BMMY (메탄올 - 복합 매체를 버퍼) :
효모 추출물 및 560 ML의 물에 16g의 펩톤 각 매체에 8g에 대해 디졸브. 액체 사이클 20 분 압력솥.
그 동안에 다음과 같은 솔루션을 준비 :- 1 M의 칼륨 인산 버퍼, pH를 6.0 :
- 10X YNB (아미노산없이 질산 황산과 함께 13.4 %의 효모 질소베이스) :
- 500X B (0.02 % 비오틴)
- 10X M (5 % 메탄올)
- 10X GY (10 % 글리세롤) :
실온으로 냉각 autoclaved 솔루션은, 다음을 추가하고 잘 섞어 보자 :- 80 ML 1 M의 칼륨 인산 버퍼, 산도 6.0;
- 80 ML 10X YNB
- 0.16 ML 500X B
- 80 ML 10X GY
4 스토어 미디어 ° C. 이 솔루션의 수명은 약 이개월입니다.
대표 결과
그림 1.이 서양 얼룩 이미지 표현 24 시간 이후 네 표현 단백질 (1605, 0537, 1228 및 1682으로 표시)를 보여줍니다. immunoblotting에 사용되는 항체는 C - myc - HRP 항체했다. 두 번째 레인 (N로 표시) 부정적인 통제하고 그들이 부모 (일반) 벡터로 변형 되었기 때문에 재조합 단백질을 표현하지 세포의 표면에 뜨는이 장전되어 있었어.
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Discussion
호스트 시스템으로 methylotrophic 효모 Pichia pastoris의를 사용하여 단백질 발현이 프로토콜에 설명되어 있습니다. 단백질이 사용된 복제 벡터에 따라 매체에 분비 수 있습니다. 재조합 단백질의 분비는 이후의 정화가 쉬워집니다. 그러나, 표시 조건이 증가 단백질 수준에서 발생할 수 있습니다 서로 다른 단백질과 조건과 표현 시대의 변화의 표현에 최적해야 할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 벡터는 C - myc의 에피토프이 에피토프을 구입할 수에 대한 항체의 기능을 지니고 있습니다. 이것은 항체가 아직 사용할 수 없습니다하는 단백질의 분석을 수 있습니다. 부모 벡터의 그의 태그 기능은 금속 chelating 수지에있는 단백질 정화를 촉진하고 사용할 수있는 벡터의 그의 태그 섹션에 대한 항체도있다.
이 프로토콜에 설명한 바와 같이, Pichia pastoris에서 단백질의 표현은 잘 계획하고 준비해야 다단계 프로세스입니다. 2~3주의 시간은 모든 단계를 수행하는 데 필요한지만 관심의 유전자와 구조의 복제 제외됩니다. P.로 성공적인 변화의 기초 pastoris 높은 변환 효율적인 능력이 효모 세포와 효모 게놈에 통합할 수 있습니다 선형 만들 수 있습니다. 서양 얼룩 분석 및 그의 태그 정화는 재조합 단백질 표현의 수준을 결정하는 응용 프로그램이며,이 프로토콜 후 수행할 수있는 다음 단계입니다.
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Acknowledgments
우리는이 작업을 지원하기위한 혁신, 브리티시 컬럼비아 기술 개발 기금, 보건 연구 (CIHR)의 캐나다 연구소에 대한 캐나다 재단 감사드립니다. MT는 미생물 다양성과 진화 (CMDE)의 툴라 기초 투자 센터에서 화목에 의해 지원되었다.
References
- Cereghino, G. P., Cregg, J. M. Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis. Curr Opin Biotechnol. 10, 422-427 (1999).
- Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. Pichia pastoris as a Host System for Transformations. Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).
- Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R.
- Cereghino, G. P., Cereghino, J. L., Ilgen, C., Cregg, J. M. Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris. Curr Opin Biotechnol. 4, 329-332 (2002).
