Summary
El protocolo describe la expresión de proteínas utilizando la levadura metilotrófica
Abstract
Expresión de la proteína microbiana en el pastoris eucariotas Pichia anfitrión ofrece la posibilidad de generar grandes cantidades de proteínas recombinantes en un sistema de expresión rápida y fácil de usar.
Como P. microorganismos unicelulares pastoris es fácil de manipular y crece rápidamente en los medios de comunicación de bajo costo en altas densidades de células. Ser una célula eucariota, P. pastoris es capaz de realizar muchas de las modificaciones posteriores a la traducción realizada por el aumento de las células eucariotas y las proteínas recombinantes obtenidas se someten plegamiento de proteínas, procesamiento proteolítico, la formación de enlaces disulfuro y glicosilación [1].
Como la levadura metilotrófica P. pastoris es capaz de metabolizar el metanol como única fuente de carbono. El gran promotor de la alcohol oxidasa, AOX1, está estrechamente regulada e inducidos por el metanol y se utiliza para la expresión del gen de interés. En consecuencia, la expresión de la proteína extraña puede ser inducida mediante la adición de metanol en el medio de cultivo [2, 3].
Otra ventaja importante es la secreción de la proteína recombinante en el medio de cultivo, utilizando una secuencia de señales para orientar la proteína extraña a la vía secretora de P. pastoris. Con bajos niveles de proteína endógena secretada a los medios de comunicación por la propia levadura y no proteínas añadidas a los medios de comunicación, una proteína heteróloga se basa la mayoría de las proteínas totales en el medio y facilita los siguientes pasos de purificación de proteínas [3, 4].
El vector utilizado (pPICZαA) contiene el promotor AOX1 para mejor regulado, metanol inducida por la expresión del gen de interés, la señal de secreción de α-factor de la secreción de la proteína recombinante, un gen de resistencia Zeocin para la selección, tanto en E. coli y Pichia y un péptido C-terminal que contiene el epítopo c-myc y polihistidina (6xHis) etiqueta para la detección y purificación de proteínas recombinantes. También muestra el análisis de Western blot de la proteína recombinante utilizando el específico anti-myc-HRP anticuerpo que reconoce el epítopo c-myc en el vector de los padres.
Protocol
Expresión de proteínas recombinantes en la levadura Pichia pastoris metilotrófica
Antes de iniciar este protocolo que debe tener su gen de interés clonado en el marco de una P. vector pastoris padres y lo han secuenciado para comprobar la correcta inserción del gen de interés en el vector.
Paso I: La generación de células de levadura electrocompetentes, linealización de la construcción y transformación en P. pastoris
Para este paso, tendrá que tener los siguientes medios y platos a mano:
- YPDS placas
- 600 ml de YPD medio
- helado de agua estéril
- 1 M sorbitol
- Amicon Ultra-4 dispositivos de filtro centrífugo
- Microcon YM-30 Unidad de filtro centrífugo
- 0,2 cm electroporación cubeta
- 15 ml tubo de vidrio estéril
- estériles de vidrio con una pipeta Pasteur
- YPDS placas que contienen Zeocin
Parte 1: Preparación de las células de levadura electrocompetentes
- Cuatro días antes de la transformación deseada racha de P. pastoris células en una placa YPDS sin Zeocin y dejarlos crecer a 30 ° C durante 1-2 días o hasta que se formen colonias aisladas.
- Dos días antes de la transformación deseada crecer 5 ml de P. pastoris cepa en medio YPD en un tubo Falcon de 50 ml a 30 ° C durante la noche. Coloque el tubo Falcon en un frasco para fijarlo en la coctelera.
- El día antes de la transformación de inocular 500 ml de medio YPD fresco en un matraz de 2 litros, con 0,25 ml de la cultura durante la noche y se dejó crecer durante la noche de nuevo en un agitador a 30 ° C hasta una DO 600 = 1.3 a 1.5.
Nota: diluir la muestra antes de medir en el espectrofotómetro para que usted obtenga un resultado preciso. - El día de la transformación tienen agua fría estéril y 1 M de sorbitol en la mano. Centrifugar las células a 1500 xg durante 5 minutos a 4 ° C. Resuspender el precipitado con 500 ml de helado, agua estéril.
- Centrifugar las células de nuevo el paso 4. Resuspender el precipitado con 250 ml de helado, agua estéril.
- Centrifugar las células de nuevo como en el paso 4. Resuspender el precipitado en 20 ml de helado de 1 M sorbitol.
- Centrifugar las células de nuevo como en el paso 4. Resuspender el precipitado en 1 ml de helado de 1 M sorbitol a un volumen final de aproximadamente 1,5 ml. Almacenan las células en hielo oa 4 ° C hasta su uso posterior.
Nota: preparamos las células más electrocompetentes de lo necesario y guárdelos en alícuotas de 80 l en tubos de microcentrífuga a -80 ° C. Nosotros usamos las células almacenadas por no más de un mes.
Parte 2: Linealización y la concentración de la construcción pPICZαA
Para la transformación de alinear el vector que contiene el gen de interés por la restricción de digerir. Usamos la PmeI enzima. Otros sitios de restricción son posibles. Usted tiene que asegurarse de que su inserción no contiene el sitio de restricción que desea utilizar para alinear su vector. Para su transformación en P. pastoris tendrá 5-20 ug de ADN lineal de 5.10 l de agua estéril.
También linealizar, concentrar y transferir el vector normal (no insertar) en P. pastoris. El vector de los padres sin la inserción es un control de la expresión intracelular de fondo y le permite interpretar los resultados de la expresión.
- Descongele todos los reactivos en hielo, se combinan los siguientes reactivos y brevemente centrifugar el tubo para obtener todo el líquido en el fondo, toque el tubo y girar de nuevo:
- x agua estéril l
- 5,0 4 l NEBuffer 10 veces
- 0,5 l de BSA 100X
- hasta 2 mg vector de ADN (~ 100 ng / l)
- 2,0 l I Pme mezcla de enzimas
Nota: para obtener suficiente ADN vector linealizado preparar la mezcla por encima de 3 o 4 veces en tubos separados y combinar las soluciones cuando la concentración del ADN digerido a través de Amicon dispositivo ultra centrífuga. - Se incuba a 37 ° C durante 3 horas y el calor inactiva la mezcla de enzimas a 65 ° C durante 20 minutos.
- Por el momento pre-enjuague un Amicon Ultra-4 dispositivos de filtro de centrífuga con 1 mL de agua Milli-Q, girar el tubo a 4000 xg durante 6-8 minutos y descartar el flujo a través.
Nota: no permitir que la membrana se seque, una vez mojada. Si usted no está utilizando el dispositivo después de pre-lavado, deje que el agua en la membrana hasta que el dispositivo se utiliza. - Transferir la solución inactivado por calor desde el paso 2 de la unidad de filtro antes de enjuagar Amicon centrífuga, girar el tubo a 4000 xg durante 6-8 minutos y descartar el flujo a través.
Nota: Si usted se ha preparado más de una mezcla de linealización, combinar todas las soluciones en una sola unidad Amicon filtro centrífugo. - Centrífuga hasta que la cantidad de solución en el filtro Amicon se reduce a aproximadamente 100 a 150 y mu, l. Añadir otro 1,5 ml de agua estéril en el tubo de vacío desde lo alto y la transferencia de la solución en el tubo de Amicon y repetir el paso de centrifugación. Lavar por segunda vez con 1,5 ml de agua estéril y deseche el flujo a través de nuevo. Reducir el volumen final de aproximadamente 150 l. Los pasos de lavado quitar la sal restante del buffer para evitar arquear al pulsar las células.
Nota: se utiliza un rotor basculante para el paso de centrifugación, simplemente coloque la tapa centrífuga Amicon unidad de filtro en un tubo Falcon de 50 ml para mantenerlo en su lugar durante el centrifugado. Amicon dispositivos de filtro de retener el 50 l de solución en el filtro, incluso después de la centrifugación prolongada. - Para una mayor concentración de la preparación de ADN de transferencia de la solución de ADN restante del dispositivo Amicon filtro a una Microcon pre-enjuagar YM-30 Unidad de filtro centrífugo y enjuagar el tubo Amicon con un adicional de 50 l de agua estéril para recuperar todo el ADN. Se centrifuga la Microcon centrífuga unidad de filtro en una microcentrífuga a 10.000 xg hasta que el filtro está todavía ligeramente cubierto con líquido. Sólo girar por un corto tiempo y comprobar cada minuto si sólo una pequeña cantidad de líquido que queda en el filtro. Para recuperar su solución de ADN, el lugar de la cabeza de filtro en un tubo nuevo de microcentrífuga y vuelta en un segundo paso de centrifugación a 1000 xg durante 3 minutos. El volumen final no debe superar los 10-15 l en total, de lo contrario su ADN podría ser demasiado diluida para la etapa de transformación.
Nota: no haga girar el dispositivo de filtro demasiado largo y que no se seque por completo para evitar la pérdida potencial de la muestra. Si la membrana está seca, añada agua estéril 10-15 l en la membrana, se agita suavemente durante 30 segundos y recuperar su ADN como se describió anteriormente.
Parte 3: La transformación en P. pastoris por electroporación
- El ADN pPICZαA lineal y concentrado que contiene el inserto está listo para su transformación en la electrocompetentes P. células pastoris (véase el paso I, parte 2). Unos 15 minutos antes de la transformación preparar los siguientes reactivos y dispositivos: llenar un tubo de microcentrífuga con 1 ml de 1 M sorbitol y colocarlo sobre el hielo, el lugar de una cubeta de 0,2 cm de electroporación en el hielo, la etiqueta de un tubo de vidrio estéril 15 ml y un estéril pipeta Pasteur de vidrio en la mano.
- Transferencia de 80 l de las células de la etapa I, parte 2.7 a un helado 0,2 cm cubeta de electroporación. Añadir la solución de ADN lineal concentrada pPICZαA desde el paso I, parte 3.6 y mezcla, moviendo la punta de la pipeta de lado a lado en la cubeta de electroporación.
Nota: cuando se añade el ADN sólo empujar una pipeta a la primera parada. Después de mezclar el ADN con las células empujan pipeta para la segunda parada y retire lentamente de la cubeta. - Incubar el tubo con las células en hielo durante 5 minutos.
- Limpie el exterior de la cubeta con un pañuelo de papel y el pulso de las células de acuerdo a los parámetros de la levadura (Saccharomyces cerevisiae) según lo sugerido por el fabricante del dispositivo de electroporación específica utilizada.
Nota: se utiliza un GenePulser Bio-Rad, con las siguientes condiciones:- La tensión de carga (V): 1500;
- Capacitancia (mF): 25;
- Resistencia (Ω): 200.
- Inmediatamente, añada 1 ml de helado de 1 M sorbitol a la cubeta. Transferir el contenido de la cubeta a un tubo estéril de 15 ml con la pipeta Pasteur de vidrio estériles.
- Deje que el tubo se incuba a 30 ° C sin agitación durante 1,5 horas.
- Añadir 5-7 perlas de vidrio esterilizado en cuatro placas de etiquetado YPDS que contiene 100 mg / mL Zeocin. Corre 250 l de la mezcla de electroporación del tubo de vidrio de 15 mL en cada plato. Agitar la placa horizontal para repartir uniformemente a las células. Deje que la placa seca durante 15 minutos y luego retire las cuentas del agar invirtiendo la placa.
Nota: utilizamos 100 mg / mL Zeocin para seleccionar transformantes cuando se utiliza la cepa de Pichia GS115. Las condiciones de selección pueden variar si se utiliza otra cepa de Pichia. - Incubar las placas de cabeza durante 2 a 3 días a 30 ° C hasta que se formen colonias. Envuelva las placas en un plástico negro para evitar la degradación de la Zeocin sensible a la luz. Menos cantidad de antibióticos en las placas pueden dar lugar a falsos positivos clones.
- Después de las colonias se han formado, recoger 12 colonias y purificarlos por rayar los clones en fresco placas YPDS que contiene 100 mg / mL de Zeocin.
Paso II: expresión de la proteína en Pichia pastoris
Para este paso, tendrá que tener los medios de comunicación después de placas, y los reactivos a la mano:
- BMGY medio
- glicerol, esterilizados
- BMMY medio
- metanol, se esteriliza
- EPICENTRO levadura de purificación de ADN kit
UstedTambién necesitamos los frascos siguientes:
- Matraz de 250 ml, autoclave
- 1 L desconcertado frasco, autoclave
- 200 vaso de precipitados, autoclave
Parte 1: expresión de la proteína en Pichia pastoris
Todos los pasos siguientes también se realizan para el control del vector transformado (sin inserción).
- Elija una sola colonia de las colonias Pichia purificada a partir de la etapa I, parte 3.9 y se inoculan en BMGY de 25 ml en un matraz aforado de 250 estériles. Crecer a 30 ° C en una incubadora de agitación (250-300 rpm) hasta que la cultura llega a un OD 600 = 2.6 (aproximadamente 16-18 horas).
Nota: diluir la muestra antes de medir en el espectrofotómetro para que usted obtenga un resultado preciso. Las células serán en el crecimiento de log-fase. - Cuando las células han alcanzado la apropiada OD 600 preparar un stock de glicerol. Transferencia de 800 l de la cultura de 25 ml de células a un vial de 2 mL Corning cyrogenic y añadir 200 l de glicerol esterilizado. Congelar el stock de glicerol y almacenar a -80 ° C.
- Para la purificación de ADN de levadura, la transferencia de 1,5 ml de la cultura de 25 ml de células en un tubo de microcentrífuga. Recoger las células por centrifugación a 1300 xg durante 1 minuto a temperatura ambiente. Estas células se utilizan para el análisis de integrantes Pichia para corroborar si el gen de interés se ha integrado en el genoma de Pichia (véase el paso II, part2). Almacenar el pellet de células a 4 ° C hasta su posterior análisis.
- Transferir el resto de la cultura de 25 ml a un tubo Falcon de 50 ml y la cosecha de las células por centrifugación a 3000 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente. Decantar el sobrenadante y se colocan los tubos boca abajo sobre un pañuelo de papel para quitar cualquier medio residual. Para lavar el pellet de células se resuspenden en 20 ml BMMY para eliminar cualquier tipo de soporte BMGY restantes, como el glicerol del medio BMGY puede inhibir la expresión más tarde. Centrifugar de nuevo a 3000 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente y decantar el sobrenadante.
- Resuspender el sedimento celular a un OD 600 de 1,0 en el medio BMMY para inducir la expresión (aproximadamente 100-200 ml) y la transferencia de la cultura en un frasco de 1 litro desconcertado. Cubra el recipiente con un vaso de 200 ml y retorno a la incubadora para continuar el crecimiento a 30 ° C.
Nota: es importante que la temperatura no supere los 30 ° C. Si la temperatura de la incubadora fluctúa, ajustar la temperatura a 28 ° C. Aireación adecuada es también un parámetro importante para la expresión eficaz en la inducción de metanol (cuando se induce la expresión, nunca superior a un volumen de cultivo> 10-30% del volumen total de frasco). Recomendamos encarecidamente el uso de frascos desconcertado, ya que introducen más oxígeno en el medio de cultivo. - Añadir metanol puro esterilizar a una concentración final de 0,5% de metanol cada 24 horas para mantener la inducción.
- En los puntos de tiempo determinado después del inicio de la transferencia de expresión 1 ml de la cultura a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar a 1300 xg durante 2,5 minutos a temperatura ambiente. Transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga independiente de 1,5 ml. Almacenar los pellets sobrenadante y células a -80 ° C hasta su posterior análisis. Las muestras de diferentes puntos de tiempo se analizarán para determinar el período de tiempo óptimo para la expresión de la proteína después de la inducción.
Nota: elegimos 6h, 12h, 24h, 36h y 48h como los puntos de tiempo para tomar las muestras. Un mayor crecimiento de hasta 4 días es posible. Los puntos de tiempo óptimo varía entre las diferentes proteínas que se expresan. - Analizar el sobrenadante y gránulos de las células para la expresión de proteínas por Coomassie manchado SDS-PAGE y Western Blot (no se describe en este protocolo).
Parte 2: La levadura de purificación de ADN y análisis de PCR de los integrantes de Pichia
Todos los reactivos necesarios para la etapa de purificación del ADN de la levadura de la cultura en Pichia BMGY se incluyen en el kit de purificación de ADN de levadura MasterPure de EPICENTRO.
Nota: este análisis es adicional y se realiza para determinar si el gen de interés se ha integrado en el genoma de Pichia. El pellet de células de una muestra de 1,5 ml tomadas de la cultura en la BMGY (véase el paso II, parte 1.3) se utiliza.
Siga las instrucciones del manual de Epicentro MasterPure levadura de purificación de ADN y realizar una PCR con el ADN de la levadura con cebadores específicos para la inserción. Analizar 3 l de su producto de PCR en un gel de agarosa que contiene 1 l de bromuro de etidio. Incluir un marcador de 1 Kb de tamaño + en un pozo de interpretar el tamaño de su inserción y visualizar el ADN utilizando una estación de documentación de geles.
La proteína recombinante puede ser analizada por Western blot. Purificación de proteínas se puede realizar mediante la purificación de su etiqueta de metal con carga de resina (no se describe en este protocolo).
Apéndice, una lista de recetas
Paso I:
- YPD medio:
Para preparar 600 mlde medio YPD (extracto de levadura peptona dextrosa Medio) disuelven 5 g de extracto de levadura y 12 g de peptona en 540 ml de agua. Autoclave durante 20 minutos en el ciclo de líquidos.
Mientras tanto preparar 70 ml de dextrosa al 20% y el filtro a esterilizar antes de su uso.
Deje que la solución en autoclave fresco a ~ 60 ° C y agregar 60 ml de esterilizadas por filtración dextrosa al 20%. - YPDS (+ Zeocin) placas:
Para preparar 500 ml de agar YPDS + Zeocin (extracto de levadura peptona dextrosa medio con sorbitol) disolver 5 g de extracto de levadura, peptona 91.1 g g de sorbitol y 10 en 450 ml de agua. Agregar 10 g de agar y una barra de agitación magnética y un autoclave durante 20 minutos en el ciclo de líquidos.
Mientras tanto preparar 60 ml de 20% de dextrosa y esterilizar por filtración antes de su uso.
Deje que la solución en autoclave fresco a ~ 60 ° C, agregar 50 ml de esterilizadas por filtración dextrosa al 20%.
Vierta unos cuantos platos antes de añadir el antibiótico para las placas sin YPDS Zeocin. A continuación, añadir 500 l Zeocin de una de 100 mg / ml de solución de valores para obtener una concentración final de 100 mg / ml Zeocin en el agar. Vamos a mezclar en un plato magnético cuando se añade el antibiótico y que revuelve alrededor de un adicional de 2 minutos para mezclar partes iguales.
Vierta los medios de comunicación en placas de Petri y se cubre con plástico negro. Deje que las placas secas en el banco durante la noche. Tienda de YPD placas que contienen Zeocin a 4 ° C. La vida útil es de una a dos semanas.
Nota: la cobertura con el plástico es necesario porque Zeocin es sensible a la luz.
Paso II:
- BMGY (glicerol tamponado complejo medio) y BMMY (buffer metanol del complejo medio):
Disolver en cada medio de 8 g de extracto de levadura y 16 g de peptona ml de agua 560. Autoclave durante 20 minutos en el ciclo de líquidos.
Mientras tanto preparar las siguientes soluciones:- 1 M de tampón fosfato de potasio, pH 6,0:
- 10X YNB (13,4% de levadura base de nitrógeno con sulfato de amonio sin aminoácidos):
- 500X B (0,02% Biotina):
- 10X M (5% de metanol):
- GY 10 veces (10% de glicerol):
Deje que la solución en autoclave enfriar a temperatura ambiente, a continuación, añadir lo siguiente y mezclar bien:- 80 ml 1 M de tampón fosfato de potasio, pH 6,0;
- 80 YNB 10X ml
- 0,16 ml 500X B
- 80 GY 10X ml
Tienda de los medios de comunicación a 4 ° C. La vida útil de esta solución es de aproximadamente dos meses.
Resultados representante
Figura 1. Esta imagen de western blot muestra cuatro proteínas que se expresan (etiquetado como 1605, 0537, 1228 y 1682) después de 24 horas de expresión. El anticuerpo utilizado para immunoblotting se un anticuerpo c-myc-HRP. El segundo carril (denominado N) es un control negativo y se cargó con sobrenadante de las células que no expresan una proteína recombinante, ya que se transformaron con el padre (natural) del vector.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Expresión de la proteína con la levadura Pichia pastoris metilotrófica como sistema anfitrión se describe en este protocolo. La proteína puede ser secretada en el medio en función del vector de clonación usada. La secreción de la proteína recombinante hace más fácil la posterior purificación. Sin embargo, las condiciones que se muestran pueden tener que ser optimizado para la expresión de proteínas diferentes y los cambios en las condiciones y los tiempos de la expresión puede resultar en niveles de aumento de la proteína. El vector utilizado en este protocolo tiene la característica de un epítopo c-myc y un anticuerpo para este epítopo se pueden comprar. Esto permite el análisis de proteínas para las que no hay anticuerpos aún no disponible. La característica de su etiqueta del vector de los padres facilita la purificación de proteínas en el metal-resina quelante y también hay un anticuerpo para la sección de su etiqueta del vector disponible.
Como se describe en este protocolo, expresión de la proteína en Pichia pastoris es una de varios pasos de proceso que debe ser bien planificada y preparada. Un tiempo de dos a tres semanas se requiere para llevar a cabo todos los pasos pero con exclusión de la clonación de la construcción con el gen de interés. La base para la transformación exitosa en P. pastoris son de alta eficiencia de transformación de células de levadura competentes y una construcción lineal que puede integrarse en el genoma de la levadura. Western blot y su etiqueta de depuración son las aplicaciones para determinar el nivel de expresión de proteínas recombinantes y son los próximos pasos a realizar después de este protocolo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a la Fundación Canadiense para la Innovación, el British Columbia Fondo de Desarrollo de conocimientos, y los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) para apoyar este trabajo. MT fue apoyado por una beca de la Fundación Centro TULA financiado por la diversidad microbiana y la evolución (CMDE).
References
- Cereghino, G. P., Cregg, J. M. Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis. Curr Opin Biotechnol. 10, 422-427 (1999).
- Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. Pichia pastoris as a Host System for Transformations. Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).
- Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R.
- Cereghino, G. P., Cereghino, J. L., Ilgen, C., Cregg, J. M. Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris. Curr Opin Biotechnol. 4, 329-332 (2002).
