Summary
Protokol Metilotropik maya kullanarak protein ekspresyonu açıklar.
Abstract
Mikrobiyal ökaryotik konak Pichia pastoris protein ekspresyonu, hızlı ve kullanımı kolay bir ifade sisteminde yüksek miktarda rekombinant protein üretme imkanı sunmaktadır .
Tek hücreli bir mikroorganizma P. gibi pastoris işlemek için kolay ve ucuz medya yüksek hücre yoğunluğu hızla büyüyor. Ökaryot, P. olmak pastoris yüksek ökaryotik hücrelerde ve elde edilen rekombinant proteinler tarafından gerçekleştirilen post-translasyonel modifikasyonlar birçok protein katlanması, proteolitik işleme, disülfit bağı oluşumu ve glikozilasyon [1] tabi gerçekleştirmek için yapabiliyor.
Metilotropik maya P. olarak pastoris tek karbon kaynağı olarak metanol metabolize yeteneğine sahiptir. Alkol oksidaz, AOX1, güçlü organizatörü, sıkı bir şekilde düzenlenir ve metanol ile indüklenen ve ilgi gen ifadesi için kullanılır . Buna göre, yabancı protein ifade besi metanol ekleyerek indüklenen olabilir [2, 3].
Diğer önemli bir avantajı, bir sinyal dizisi kullanarak P. pastoris sekretuar yolu yabancı bir proteini hedef, büyüme ortamına rekombinant protein salgılanmasını. Heterolog protein, medya maya kendisi tarafından salgılanan endojen protein ve medya için hiçbir katma proteinler sadece düşük seviyeleri ile total protein, orta ve büyük çoğunluğu oluşturur ve protein saflaştırılması adımları izleyerek kolaylaştırmaktadır [3, 4].
Rekombinant protein, E. her iki seçim için bir Zeocin direnç geninin salgılanması için α-faktörü salgılanması sinyali Burada kullanılan vektör (pPICZαA) faiz gen sıkı bir şekilde düzenlenir, metanol indüklenen ifade AOX1 organizatörü içeren coli ve Pichia ve c-myc epitopu ve rekombinant protein algılama ve saflaştırılması için polyhistidine (6xHis) etiketi içeren bir C-terminal peptid. Ayrıca, ana vektörü, c-myc epitop tanıma Anti-myc-HRP antikor kullanarak rekombinant protein batı blot analizi göstermektedir .
Protocol
Metilotropik maya Pichia pastoris rekombinant proteinlerin İfade
Bu protokol başlamadan önce bir P. çerçeve klonlanmış ilgi geni olmalıdır doğru yerleştirilmesi için vektör ilgi gen kontrol etmek için pastoris ebeveyn vektör ve sıralı var.
Adım: P. içine yapı ve dönüşüm doğrusallaştırma electrocompetent maya hücreleri pastoris
Bu adım için, elinizin altında şu medya ve plakalar olması gerekir:
- YPDS plakalar
- 600 mL YPD orta
- steril su buz gibi
- Sorbitol 1 m
- Amicon Ultra-4 Santrifüj Filtre Cihaz
- Microcon YM-30 Santrifüj Filtre Ünitesi
- 0.2 cm elektroporasyon küvet
- 15 ml steril cam tüp
- steril cam Pasteur Pipet
- Zeocin içeren YPDS plakalar
Bölüm 1: electrocompetent maya hücreleri Hazırlık
- Dört gün önce P. dışarı hedeflenen dönüşümün çizgi Zeocin olmadan YPDS plaka pastoris hücreleri ve bunları 30 ° C, 1-2 gün ya da tek bir koloni oluştururlar kadar büyümesine izin.
- Amaçlanan dönüşüm İki gün önce sizin P. 5 ml büyüyecek 30 50 ml Falcon tüp YPD orta pastoris gerginlik ° C geceleme. Falcon tüp çalkalayıcı bunu düzeltmek için bir şişe yerleştirin.
- Önceki gün 0.25 gecelik kültür 30 çalkalayıcı gecede tekrar büyümesine izin ° C OD 600 = 1,3-1,5 ml ve 2 litrelik bir şişeyi taze YPD orta dönüşüm inokülasyon 500 ml .
Not: spektrofotometre ölçüm doğru bir sonuç elde edebilmeniz için önce örnek sulandırmak. - Dönüşümün gün buz steril su ve 1 M sorbitol elinizin altında vardır. 4 5 dakika için 1500 xg'de hücreleri Santrifüj ° C 500 ml, buz gibi soğuk, steril su ile pelletini tekrar.
- 4. adımı olarak hücreleri yeniden santrifüjleyin. 250 mL, buz gibi soğuk, steril su ile pelletini tekrar.
- 4. adımda hücreleri tekrar santrifüjleyin. Sorbitol buz 1 M 20 ml pelletini tekrar.
- 4. adımda hücreleri tekrar santrifüjleyin. ~ 1.5 mL nihai hacmi sorbitol buz 1 M 1 mL pelletini tekrar. 4 ° C daha sonra kullanmak kadar buz üzerinde veya Mağaza hücreleri.
Not: gerektiğinden daha fazla electrocompetent hücreleri hazırlamak ve mikrosantrifüj tüplerde 80 ul hacimde saklayın -80 ° C Biz, bir aydan daha uzun süre saklanan hücreler kullanır.
Bölüm 2: Lineerleştirme ve pPICZαA inşa konsantrasyonu
Dönüşümü için kısıtlama sindirmek ilgi gen içeren vektör linearize. Biz enzim PmeI kullanırlar. Diğer kısıtlama siteleri mümkündür. Eklemek vektör linearize için kullanmak istediğiniz kısıtlama sitesi içermediğinden emin olmak için var. P. içine dönüşüm için pastoris 5-20 mikrogram 5-10 ul steril su Lineerleştirilmiş DNA gerekecektir.
Ayrıca, linearize konsantre ve P. içine düz vektör (insert) transfer pastoris. Eklemek olmadan ana vektörü, arka plan hücre içi ifade etmek için bir kontrol ve size ifade sonuçlarını yorumlamak sağlar.
- Buz üzerinde tüm reaktifler çözülme, aşağıdaki reaktifler birleştirmek ve kısaca tüp altındaki tüm sıvı almak için santrifüj tüp dokunun ve tekrar döndürebilirsiniz:
- x ul steril su
- 5.0 ul 10X NEBuffer 4
- 0.5 ul 100X BSA
- 2 mg vektör DNA (~ 100 ng / ml)
- 2.0 ul pme I enzim karışımı
Not: Yeterli Lineerleştirilmiş vektör DNA elde etmek için ayrı tüplerde yukarıdaki karışımı 3 veya 4 kez hazırlamak ve Amicon Ultra Santrifüj Cihaz ile sindirilir DNA konsantre çözümleri birleştirmek. - 37 ° C, 3 saat ve 20 dakika boyunca ısı 65 ° C'de enzim karışımı etkisiz hale inkübe edin.
- Bu arada, Milli-Q su 1 ml ile bir Amicon Ultra-4 Santrifüj Filtre Cihaz ön durulama 6-8 dakika 4000 xg'de tüp spin ve akış yoluyla atın.
Not: membran kez ıslak kurumasına izin vermeyin. Cihazın ön durulandıktan sonra cihaz kullanmıyorsanız kullanılıncaya kadar, membran su bırakın. - Isı ile inaktive edilmiş çözüm için adım 2 transfer öncesi durulanır Amicon Santrifüj Filtre Ünitesi, 6-8 dakika 4000 xg'de tüp spin ve üzerinden akış atın.
Not: Birden fazla doğrusallaştırma karışımı hazırlanan varsa, bir Amicon Santrifüj Filtre Ünitesi tüm çözümleri birleştirmek. - Amicon filtre çözüm miktarı yaklaşık 100 kadar Santrifüj ~ 150 & mu; l. Yukarıda boş bir tüpe 1,5 mL steril su başka bir ekleyin ve çözüm Amicon tüp transferi ve santrifüj adımı tekrarlayın. Ikinci kez 1.5 ml steril su ile yıkayın ve tekrar yoluyla akışı atın. ~ 150 ul son hacmi azaltın. Çamaşır adımları hücreleri darbeli arching önlemek için tampon kalan tuz çıkarın.
Not: santrifüj basamağı için sallanan bir kova rotor kullanır; santrifüj sırasında bir yerde tutmak için 50 ml Falcon tüp kapaklı Amicon santrifüj filtre ünitesi yerleştirebilirsiniz. Amicon filtre cihazları uzun santrifüj sonra bile filtre çözüm 50 ul korur. - DNA hazırlığı daha fazla konsantrasyon için bir ön-durulanır Microcon YM-30 Santrifüj Filtre Ünitesi Amicon filtre cihazı kalan DNA çözüm transferi ve Amicon tüp tüm DNA kurtarmak için ek 50 ul steril su ile durulama. Bir mikrosantrifüj Microcon Santrifüj Filtre Ünitesi filtre hala biraz sıvı ile kaplıdır kadar 10.000 xg'de santrifüjleyin. Sadece kısa bir süre için spin ve sadece küçük bir miktar sıvı filtre bırakılırsa her dakika kontrol edin. DNA çözümü kurtarmak için, 3 dakika boyunca 1000 xg ikinci bir santrifüj adım yeni bir mikrosantrifüj tüp ve spin filtre baş aşağı yerleştirin. Son hacmi, toplam 10-15 ul geçmemelidir, aksi takdirde DNA çok dönüşüm adım için sulandırılmış olabilir.
Not: filtre cihaz çok uzun spin ve potansiyel örneklem kaybını önlemek için tamamen kurumasını izin yok. Membran kuru ise, membran 10-15 ul steril su ekleyip 30 saniye hafifçe ajitasyon ve yukarıda açıklandığı gibi DNA kurtarmak.
Bölüm 3: P. Dönüşüm; elektroporasyon tarafından pastoris
- Şimdi eklemek içeren Lineerleştirilmiş ve konsantre pPICZαA DNA electrocompetent P. dönüşüm için hazır pastoris hücreleri (bkz. adım Ben, bölüm 2). Buz üzerinde 0.2 cm elektroporasyon küvet; yer; sorbitol 1 M 1 ml ile mikrosantrifüj tüp doldurmak ve buz üzerinde etiket steril 15 ml'lik cam tüp içinde ve steril bir var: dönüşüm yaklaşık 15 dakika önce aşağıdaki reaktifler ve cihazlar hazırlamak Pasteur pipeti elinizin altında cam.
- Buz gibi bir 0.2 cm elektroporasyon küvet adım Ben, parçası 2.7 hücrelerin 80 ul aktarın. Elektroporasyon küvet, yan-yan pipet hareket ettirerek adım Ben, parçası 3.6 ve karışımı konsantre lineerleştirilmiş pPICZαA DNA çözüm ekleyin.
Not: DNA ekleyerek ilk durağı sadece pipet itin. Hücrelerin DNA karıştırıldıktan sonra ikinci durağı pipet itme ve küvet yavaşça çıkarın. - 5 dakika boyunca buz üzerinde hücreleri küvet inkübe edin.
- Bir doku ile küvet dışını silin ve kullanılan özel elektroporasyon cihaz üreticisi tarafından önerilen maya (Saccharomyces cerevisiae) parametrelere göre hücreler darbe.
Not: aşağıdaki koşullar ile Bio-Rad GenePulser kullanın:- Şarj voltajı (V): 1500;
- Kapasitans (μF): 25;
- Direnci (Ω): 200.
- Hemen buz küvet için sorbitol 1 M 1 mL ekleyin. Steril cam Pasteur pipeti kullanarak 15 ml steril bir tüp küvet içerik aktarma.
- 30 ° C'de 1.5 saat sallayarak olmadan tüp inkübe edelim.
- 100 mg / ml Zeocin içeren dört etiketli YPDS plakaları 5-7 steril cam boncuk ekleyin. 250 ul her bir plaka üzerinde 15 ml'lik cam tüp elektroporasyon karışımı sürün. Yatay hücreler eşit yaymak için plaka çalkalayınız. Plaka 15 dakika boyunca kuru ve sonra agar plaka tersini boncuk kaldırmak.
Not: GS115 Pichia gerginlik kullanırken transformants seçmek için 100 mg / ml Zeocin. Başka bir Pichia gerginlik kullanıyorsanız, seçim şartları değişebilir. - Koloniler oluşana kadar 2 ila 3 gün 30 ° C ters tabak inkübe. Işığa duyarlı Zeocin bozulması önlemek için siyah plastik tabak sarın. Plakalarda antibiyotik az miktarda, yanlış pozitif klonların neden olabilir.
- Koloniler sonra, 12 koloniler almak ve 100 mg / Zeocin ml içeren taze YPDS plakaları klonlar bulaşması, onları arındırıp-temizleyen.
Adım II: Protein ifade Pichia pastoris
Bu adım için, elinizin altında şu medya, tabak ve reaktifler olması gerekir:
- BMGY orta
- gliserol, sterilize
- BMMY orta
- metanol, sterilize
- Epicentre Maya DNA saflaştırma kiti
SizeAyrıca aşağıdaki şişeler gerekir:
- 250 ml şişesi, otoklava
- 1 L şaşkın şişesi, otoklava
- 200 ml beher, otoklava
Bölüm 1: Pichia pastoris Protein ekspresyonu
Aşağıdaki adımları da dönüştürülmüş kontrol vektör (eklemek) için yapılır.
- Adım Ben, parçası 3,9 saflaştırılmış Pichia koloniler tek bir koloni seçin ve steril 250 ml cam şişe içinde 25 ml BMGY aşılamak. 30 ° C kadar bir kültür sallayarak inkübatör (250-300 rpm) bir OD 600 ulaşır = 2-6 (yaklaşık 16-18 saat). Büyümek
Not: spektrofotometre ölçüm doğru bir sonuç elde edebilmeniz için önce örnek sulandırmak. Hücreler log-faz büyüme olacaktır. - Hücreleri bir gliserol stok hazırlamak uygun OD 600 ulaşmıştır. 2 mL Corning cyrogenic flakon, 25 ml hücre kültürü 800 ul aktarın ve 200 ul steril gliserol ekleyin. -80 Gliserol stok ve mağaza Freeze ° C
- Maya DNA saflaştırılması için, bir mikrosantrifüj tüpe 1,5 ml 25 ml hücre kültürü aktarmak. Oda sıcaklığında 1 dakika için 1300 xg'de santrifüj hücreleri Hasat. Bu hücreler, Pichia genomu (bkz. adım II, part2) entegre ilgi gen varsa çift kontrol Pichia integrants analiz etmek için kullanılır . 4 hücre pelletini Mağaza ° C daha fazla analiz kadar.
- Geri kalanı için 25 ml kültür 50 ml Falcon tüp transferi ve oda sıcaklığında 5 dakika 3000 xg'de santrifüj hücreleri tarafından hasat. Durusu süpernatant ve herhangi bir kalıntı ortamı çıkarmak için, baş aşağı bir doku tüpler yerde. Hücre yıkamak için pelet, kalan BMGY ortamı kaldırmak için daha sonra ifade BMGY orta gliserol olarak inhibe edebilir 20 ml BMMY tekrar süspansiyon haline getirin. Yine oda sıcaklığında 5 dakika 3000 xg'de santrifüjleyin ve süpernatantı süzün.
- BMMY orta 1.0 OD 600 yeniden süspanse hücre pelletini ifadesi neden (yaklaşık 100-200 ml) ve 1 litre şaşkın balonuna kültür aktarmak için. 200 ml beher balon kapak ve 30 büyümeye devam inkübatör dönmek ° C.
Not: aşağıdaki sıcaklık 30 aşmayacak şekilde önemlidir ° C Inkübatör dalgalanma sıcaklık, 28 sıcaklık ° C Yeterli havalandırma metanol indüksiyon sırasında etkin bir şekilde ifade etmek için de önemli bir parametredir (ifade inducing zaman, hiç bir kültür hacmi> toplam balon hacminin% 10-30 fazla). Kültür ortamı daha fazla oksijen tanıtmak Biz oldukça şaşkın şişeler kullanmanızı öneririz. - Indüksiyon korumak için her 24 saatte bir final konsantrasyon% 0.5 metanol steril saf metanol ekleyin.
- 1.5 mL mikrosantrifüj tüp kültürünün ifadesi transferi 1 ml başladıktan sonra belirli zaman noktalarında. 2.5 dakika oda sıcaklığında 1300 xg'de santrifüjleyin. Süpernatantı ayrı bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Daha fazla analiz zamanına kadar -80 supernatant ve hücre pelletleri ° C saklayın. Indüksiyon sonrası protein ekspresyonu için optimal süre kurmak için farklı zaman noktalarında örnekler ele alınacaktır.
Not: 6h örnekleri alınması için zaman noktaları olarak, 12 saat, 24 saat, 36H ve 48 saat seçin. 4 gün daha fazla büyüme mümkündür. En uygun zaman noktalarında farklı ifade proteinler arasında değişmektedir. - Coomassie lekeli SDS-PAGE ve western blot (Bu protokol açıklanmayan), protein ekspresyonu süpernatantlar ve hücre pelletleri analiz edin.
Bölüm 2: Maya Pichia bütünleyici DNA saflaştırma ve PCR analizi
BMGY Pichia kültür maya DNA arıtma adım için gerekli tüm reaktifler Epicentre MasterPure Maya DNA Saflaştırma Kit dahildir.
Not: Bu analiz ek ve ilgi gen Pichia genom entegre olup olmadığını belirlemek için yapılır. BMGY kültür (bkz. adım II, Kısım 1.3) alınan 1.5 mL örnek hücre pelletini kullanılır.
Epicentre MasterPure Maya DNA Saflaştırma kılavuzu, talimatları uygulayın ve eklemek için spesifik primerler ile maya DNA'sı ile PCR çalışması. 1 ul etidyum bromür içeren bir agaroz jel üzerinde PCR ürünü 3 ul analiz edin. 1 Kb + boyutuna işaretleyici eklemek boyutu yorumlamak ve bir jel dokümantasyon istasyonu kullanarak DNA görselleştirmek için iyi bir ekleyin.
Rekombinant protein western blot analizi ile analiz edilebilir. Protein saflaştırma metal ücret reçine (Bu protokol açıklanan) His-tag arıtma yapılabilir.
Ek, yemek tarifleri listesi
Ben Adım:
- YPD orta:
600 mL hazırlamak içinYPD orta (Maya Özü Peptonlu Dekstroz Orta) 540 ml su 5 gr maya özü ve 12 g pepton çözülür. Sıvı döngüsü 20 dakika Otoklav.
Bu arada 70 mL% 20 dekstroz ve filtre kullanmadan önce sterilize hazırlar.
Otoklavlanmış çözüm serin ~ 60 ° C ve 60 mL% 20 dekstroz filtre ile sterilize edilmiş eklemek edelim. - YPDS (+ Zeocin) plakaları:
YPDS 500 ml + Zeocin agar (Maya Özü ile Sorbitol Peptonlu Dekstroz Medium) 5 g maya özü, 450 ml su içinde 91,1 g sorbitol ve 10 g pepton çözülür hazırlamak. 10 g agar ve sıvı döngüsü 20 dakika boyunca bir manyetik karıştırıcı ve otoklav ekleyin.
Bu arada 60 mL% 20 dekstroz ve filtre kullanmadan önce sterilize hazırlar.
Otoklavlanmış çözüm serin ~ 60 ° C, 50 ml filtre ile sterilize edilmiş% 20 dekstroz eklemek edelim.
Zeocin olmadan YPDS plakaları için antibiyotik eklemeden önce birkaç tabak dökün. Sonra nihai konsantrasyonu 100 mg / ml Zeocin agar elde etmek için 100 mg / ml stok solüsyonu 500 ul Zeocin ekleyin. Antibiyotik eklerken bir manyetik plaka üzerinde karıştırın ve eşit karışımı bir ek yaklaşık 2 dakika karıştırın izin alalım.
Medya Petri kaplarına dökün ve siyah plastik ile kaplayın. Gece bankta tabak kuru olsun. 4 Zeocin içeren Mağaza YPD plakaları ° C Raf ömrü 1-2 haftadır.
Not: Zeocin ışığa duyarlı olması nedeniyle plastik ile kapsama alanı gereklidir.
II Adım:
- BMGY (Tamponlu gliserol-kompleks Orta) ve BMMY (Metanol-kompleks Orta Tamponlanmış):
Maya özü ve 560 ml su içinde 16 g pepton her orta 8 g çözülür. Sıvı döngüsü 20 dakika Otoklav.
Bu arada aşağıdaki çözümleri hazırlar:- 1 M potasyum fosfat tamponu, pH 6.0:
- 10X YNB (amino asitler olmadan Amonyum Sülfat% 13.4 Maya Azot Base):
- 500X B (0.02% Biotin):
- 10X M (5% Metanol):
- 10X GY (% 10 Gliserol):
Oda sıcaklığına kadar soğumasını otoklavlanmış çözüm, sonra aşağıdaki ekleyin ve iyice karıştırın bakalım:- 80 ml 1 M potasyum fosfat tamponu, pH 6.0;
- 80 ml 10X YNB
- 0.16 ml 500X B
- 80 ml 10X GY
Mağaza medya ° C 4 Bu çözümün raf ömrü yaklaşık iki aydır.
Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1: Bu western blot görüntü, 24 saat sonra ifade dört ifade proteinleri (1605, 0537, 1228 ve 1682 olarak etiketli) gösterir . Immunoblotting için kullanılan antikor c-myc-HRP antikor oldu. Ikinci şerit (N) etiketli bir negatif kontrol ve ebeveyn (düz) vektörü ile dönüştürülmüş olması nedeniyle, rekombinant protein ifade hücreleri süpernatant yüklü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protein ifade Metilotropik maya Pichia pastoris bir ana sistem olarak kullanarak, bu protokolde açıklanmıştır . Protein kullanılan klonlama vektörü bağlı olarak ortama salınır. Rekombinant proteinin salgılanmasını sonraki arıtma kolaylaştırır. Ancak, gösterilen koşullar artan protein düzeyleri neden olabilir farklı proteinler ve koşulları ve ifade kez değişiklikleri ifade için optimize gerekebilir. Bu protokolde kullanılan vektör, c-myc epitop ve bu epitop satın alınabilir bir antikor özelliğine sahiptir . Bu henüz hiçbir antikorlar mevcut olan proteinlerin analizi sağlar. Ana vektörü His-tag özelliği, metal-şelat reçine protein saflaştırılması kolaylaştırır ve mevcut vektör His-tag bölümü için bir antikor da var.
Bu protokol de açıklandığı üzere, Pichia pastoris protein ekspresyonu, iyi planlanmış ve hazırlanmış olması gereken çok adımlı bir süreçtir . 2-3 haftalık bir zaman tüm adımları gerçekleştirmek için gerekli ama ilgi gen ile inşa klonlama hariç. P. içine başarılı bir şekilde dönüşümü için temel pastoris yüksek dönüşüm verimli yetkili maya hücreleri ve maya genomu entegre bir Lineerleştirilmiş inşa edilir. Western blot analizi ve His-tag arıtma rekombinant protein ifade düzeyini belirlemek için uygulamalar ve bu protokol sonra gerçekleştirmek için bir sonraki adım.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz bu işi desteklemek için Kanada Vakfı Yenilik, British Columbia Bilgi Kalkınma Fonu ve Kanada Sağlık Araştırmaları (CIHR) Enstitüleri için teşekkür etmek istiyorum. MT Mikrobiyal Çeşitlilik ve Evrim (CMDE) TULA vakıf tarafından finanse edilen Merkezi bir burs ile desteklenmiştir.
References
- Cereghino, G. P., Cregg, J. M. Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis. Curr Opin Biotechnol. 10, 422-427 (1999).
- Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. Pichia pastoris as a Host System for Transformations. Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).
- Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R.
- Cereghino, G. P., Cereghino, J. L., Ilgen, C., Cregg, J. M. Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris. Curr Opin Biotechnol. 4, 329-332 (2002).
