Single-единицы В естественных условиях Записи из зрительных нервов Крысы

Summary

Ганглиозные клетки сетчатки передают зрительную информацию от глаза к мозгу с последовательностями потенциалов действия. Здесь показано, как для записи потенциалов действия одиночных клеток ганглия

Abstract

Информация о визуальном мире передается в мозг по последовательности потенциалов действия в ганглиозных клеток сетчатки аксонов, составляющих зрительный нерв.

Protocol

Часть I: Производство вольфрама-в-Стекло Электроды

1. Графитовым кольцом помещается в стакан заполненный концентрированным раствором нитрата натрия (0.71g/mL) и гидроксид калия (0.34g/mL), растворенные в воде ^1, и стакан помещают под швейное руку изменение швейной машины .
2. Вольфрам провод (0,5 мм диаметром 6 см длины), приклеенный к швейной руку так, чтобы он частично погруженный (1-2см) в растворе.
3. 2В применяются по всей вольфрамовой проволоки, присоединяя положительные привести к швейной руку и привести к отрицательным графитовым кольцом.
4. Швейная машина включена и вольфрамовой проволоки погружают в раствор повторно со скоростью ~ 4 Гц в течение 2 мин, который электролитическим гравирует металла острия.
5. Травление проволоки помещается на ручной микроманипулятора и точки выровнены при микроскопическом руководства (40-кратном увеличении) с валом стеклянную пипетку (0,25 мм OD, 0.175mm ID) тянутся к наконечник 1 мм со стеклянной съемника. Чтобы предотвратить смещение во проволоки вставки стекла временно закреплен на столике микроскопа с замазкой.
6. Провод тщательно передовых в unpulled конце стекла, в шахту, и через 1 мкм открытия небольшой кусочек стекла видно разорвать чаевые в видео, что указывает на плотную посадку из вольфрама в стекле. Проволока должна распространяться по всему 5-10мм за наконечник для записи оптических крысы волокна.
7. Цианоакрилат применяется к unpulled конце стекла и после затвердевания электрическое сопротивление измеряется, где 1МОм электродов как правило, работают лучше всего.

Часть II: стереотаксической установки и записи Спайк поезд

1. Система стимулов дисплей показано на видео, наряду с стереотаксического аппарата и Microdrive для позиционирования и опускания электродов в мозг.
2. Для выполнения сетчатки поезд шип записи крысы под наркозом, а затем парализован. Стандартные процедуры (не показаны) используются для хирургической вставки бедренную вену канюлю для доставки лекарств и трахеи (Y-трубка) канюля для искусственной вентиляции легких во время паралича. Эксперименты терминал для животных.
3. После подготовительных процедур, животное находится на обогрев одеяло и голова фиксируется в стереотаксической позиции, как это определено в головном мозге крыс атлас ^2, с уха и зубов баров.
4. Ректальный зонд вводится, который управляет отоплением одеяло через теплокровных блок управления, который поддерживает температуру тела при температуре 37 ° C.
5. Металл иглы используются как мера приводит к ЭКГ и монитором частоты сердца.
6. Кожа открылся в верхней части черепа и пересечения черепа пластинами (брегмы) подвергается. Специально разработанный перекладину кадра установлен на месте, круг отмечается черепа вокруг Бегма через отверстие в перекладину, и перекладины временно удалены.
7. Стереотаксической системы калибровки, позиционируя руководство иглу над брегмы. 5-мм отверстие просверленное в череп в отмеченных месте и кости удаляют, подвергая головной мозг. Тонкие кольца шпатлевка, расположенных вокруг отверстие в черепе, чтобы сформировать уплотнение вокруг отверстия в перекладину, который сбрасывается на место.
8. Если животное было на стабильном плоскости анестезии на некоторое время, он вводится с паралитическим в целях предотвращения движения глаз во время сбора данных. После остановки дыхания животного искусственной вентиляции легких. Пользовательскую программу треков вентиляции и физиологические параметры в течение всего эксперимента и сообщает экспериментатору, если компенсационные меры необходимы какие-либо параметры должны выйти на улицу нормального уровня.
9. Руководство игла backloaded с вольфрамовым электродом и опустил в мозг. После проникновения мозга перекладины отверстие заполняется агара (не показаны), а также сборка Microdrive крепится к перекладине для механической стабильности. Вольфрамовый электрод, затем медленно продвигались (2μm/sec) из руководства иглы до кончика составляет около 8-9мм ниже черепа, где зрительного перекреста находится.
10. Спайк поездов принадлежащих ганглиозных клеток сетчатки идентифицируются по их реакции на визуальные вход. После изоляции одного оптического волокна рецептивного поля записаны клетка переходит в визуальное пространство и его свойства ответ характеризуются дрейфующих решетки или других визуальных образов, представляющих интерес. Стабильность системы позволяет единичные записи нескольких часов ^3.

Материалы

Взрослый Браун-Норвегия крыс (250-400г) были куплены у коммерческих поставщиков и размещается под регулируемым (12/12) светлый / темный цикла. Анестезия индуцировали внутрибрюшинного введения кетамина гидрохлорид и ксилазина (70 и 2 мг / кг соответственно, Генри Шайн Inc) и поддерживается на протяжении всего экспериментаiment с внутривенной инфузии кетамина и ксилазина (30 и 1 мг / кг / ч), смешанного с раствором декстрозы, физиологическим раствором, и gallamine triethiodide (40 мг / кг / ч, Фишер Inc) через катетер (диаметр 0,13 мм, мелкие детали Inc ) в правую бедренную вену. Gallamine входит в смесь, чтобы парализовать движение глаз. Инфузии скорость насоса (WPI Inc) была скорректирована по мере необходимости для поддержания стабильной плоскости анестезии по оценке сердечного ритма и вариабельности артериального давления. После параличи, животное искусственной вентиляции легких (Harvard аппарата, модель 683) через трахеи канюли в 60-80 вдохов / мин (2CC объема), со скоростью с корректировками, необходимыми для поддержания в конце выдоха CO ₂ измеряется в линию капнометра (Novametrix Inc, модель 710Sp) на 30%. Температура тела, регулируется с помощью системы управления теплокровных одеяло (Harvard Аппарат Inc). Температура тела, в конце выдоха CO _2, частоты сердечных сокращений и артериального давления постоянно контролируется в течение всего эксперимента по программе LabVIEW. Визуальные стимулы были представлены на Sony Multiscan 17е ЭЛТ-монитор (средняя яркость 30 кд / м ^2), работающих на частоте 100 Гц с разрешением 800x600 пикселей. Сбор данных и вывод на монитор контролировались с помощью пользовательских программ, написанных в Matlab и LabView в сочетании с процессором видеоизображения (Cambridge Research Systems Inc, биты + +) и психофизики Toolbox ^4. Животных рассматривается стимул дисплей (40,4 х 30,2 см) на расстоянии 16,5 см через контактные линзы (Глазные Instruments Inc), и офтальмологического раствора был применен периодически во время эксперимента, чтобы сохранить глаза влажными. Поля зрения доступных для стимуляции было развернуто с помощью обратного монтажа животное в стереотаксического аппарата (Stoelting Co) повышенных 14 см над поверхностью плавающей таблицы (TMC Inc) и установки монитора на специально разработанных сани, движущаяся по таблице вместе ± 100 градусов дуги вокруг носа. Это при условии, перемещаемый поле дисплея, что расширенные 60-градусов выше, и 35-градусов ниже уровня глаз и ± 42-градусов в сторону от центра монитора. Вольфрам electodes были сфабрикованы с проволокой полученные из мелких деталей Inc и пользовательские боросиликатного стекла, полученного из Фридриха и Диммок Инк стандартных micropippete съемник (Саттер инструменты, модель P-97) был использован для формы стеклянным наконечником. Тестер сопротивления электрод был приобретен у Бака-Electronics. Электроды были выдвинуты с моторизованным Microdrive системы (Newport Inc, StepperMike). Электрокардиограмма и зрительного нерва сигналы после усиления фильтруется с высоким входным сопротивлением многоэлектродной усилителя (FHC Inc, X-Cell 3х4). Сердце бьется были обнаружены с окна дискриминатора (WPI Inc, модель 121). Нервные потенциалы действия были обнаружены и временными метками с 0,1 мс резолюции цифровой шип дискриминатора (FHC Inc, APM). Шип дискриминатор был закрытый от запускающего сигнала от процессора видео изображения так, чтобы шип времена были привязаны к стимулу.

Discussion

Оптические волокна записи привлекательным подхода к решению вопросов о экспериментальные сетчатки кодирования и передачи информации, которые требуют неповрежденный глаз. Кроме того, сигнализации свойства обоих глазах могут быть изучены практически в том же физиологическом состоянии, если электрод расположен в зрительных нервов или тракта, где деятельность перекрестный и неперекрестный волокон зрительного нерва могут быть записаны с помощью одного проникновения электрода. Оптические волокна записи распространены в кота, но не в других популярных моделей животных, используемых в исследовании зрения, такие как грызуны, возможно, по причине их малого размера. Мы постарались различных коммерческих электродов подобного сопротивления и материальных, ни одна из которых были успешными в собирание отдельного вида деятельности волокна в крысу, не говоря уже о записи его в течение нескольких часов, как наши электроды могут. Это означает, что особенности геометрии наши электроды, которые имеют длинный, острый кончик, а не широким тупым кончиком типичные коммерческие, имеет важное значение для надежного и стабильного изоляции аксонов ганглиозных клеток поездов шип. В дополнение к показывающий, как изготовить эти электроды, мы проиллюстрируем наш специально разработанный стереотаксической системы в естественных визуальных нейрофизиологических исследований. Система построена для защиты высокое сопротивление микроэлектрода от экологической вибрации и электромагнитных шумов. Это очень важно для записи малых потенциалов действия производятся по аксонам (по сравнению с клеточных тел) в течение длительного периода времени, особенно с компьютерного монитора расположены неподалеку. Он делает это с исключительной стабильностью и отношение сигнал-шум, с типичными время записи одного часа или более, а уровень шума порядка десятков микровольт. Эти особенности делают установку особенно полезны для зрения исследователей, направленные на запись в естественных условиях из нервных волокон сетчатки или других участках мозга.