יחידה יחידה ב-vivo הקלטות של התצלובת הראייה של עכברוש

Summary

בתאי הגנגליון ברשתית מעבירים מידע חזותי מן העין אל המוח עם רצפים של פוטנציאל פעולה. כאן, אנו מדגימים כיצד להקליט את פוטנציאל הפעולה של תאים גנגליון יחיד

Abstract

מידע על עולם חזותי מועבר למוח ברצפים של פוטנציאל פעולה הרשתית האקסונים תא גנגליון היוצרים את עצב הראייה.

Protocol

אני חלק: המצאה של טונגסטן ב-Glass אלקטרודות

1. טבעת גרפיט ממוקם כוס מלא עם פתרון מרוכזת של נתרן חנקתי (0.71g/mL) ו אשלגן הידרוקסיד (0.34g/mL) מומס במים ^1, ואת כוס ממוקמת מתחת לזרוע התפירה של מכונת תפירה שונה .
2. תיל טונגסטן (0.5mm קוטר, אורך 6cm) הוא מודבק הזרוע תפירה כך הוא שקוע חלקית (1-2cm) בתמיסה.
3. 2V מוחלים מעבר לגדר טונגסטן על ידי הצמדת להוביל חיובית הזרוע תפירה להוביל שלילי לזירה גרפיט.
4. מכונת התפירה מופעל חוט טונגסטן הוא טבל שוב ושוב בקצב של ~ 4Hz במשך 2 דקות, אשר אלקטרוליטים etches המתכת לנקודה חדה לתוך פתרון.
5. החוט חרוט מושם על micromanipulator מדריך ונקודת מיושר תחת הדרכתו מיקרוסקופיים (בהגדלה 40X) עם פיר של פיפטה זכוכית (0.25mm OD, 0.175mm ID) משכו אל קצה 1mm עם חולץ זכוכית. כדי למנוע תנועה במהלך החדרת תיל, זכוכית מאובטח זמנית על הבמה מיקרוסקופ עם מרק.
6. חוט הוא מתקדם בזהירות לתוך סוף unpulled של הזכוכית, דרך פיר, וכן דרך הפתח 1μm פיסה קטנה של זכוכית נראית לנתק את קצה של וידאו, מה שמעיד על התאמה הדוקה של הטונגסטן בכוס. החוט צריך להאריך סביב 5-10mm מעבר לקצה עבור הקלטות עכברוש סיבים אופטיים.
7. Cyanoacrylate מוחל סוף unpulled של הזכוכית לאחר התקשות עכבה חשמלית נמדדת, שם אלקטרודות 1MΩ בדרך כלל את העבודה הטובה ביותר.

חלק שני: הגדרת Stereotaxic והקלטות ספייק רכבת

1. מערכת התצוגה גירוי מומחש וידאו, יחד עם המנגנון Microdrive stereotaxic ועל מיצוב והורדת אלקטרודה למוח.
2. כדי לבצע רשתית הקלטות ספייק הרכבת עכברוש הוא מורדם ומשותק מאוחר יותר. נהלים רגילה (לא מצויר) משמשים הכניסה כירורגית של צינורית עורק הירך עבור משלוח הסמים ואת צינורית לקנה הנשימה (Y-tube) אוורור מכני במהלך שיתוק. הניסויים הם מסוף החיה.
3. לאחר תהליך הכנה, החיה מושם על השמיכה חימום הראש מקובע למקומו stereotaxic, כפי שהוגדר על ידי מוח החולדה אטלס ^2, עם אוזן וברים השן.
4. בדיקה רקטלית מוכנס, אשר שולטת על שמיכה חימום באמצעות יחידת בקרת homeothermic המקיימת את טמפרטורת הגוף על 37 ° C.
5. מחט מתכת משמשים מוביל למדוד את קצב הלב ואת רל לפקח.
6. העור הוא פתח על גבי הגולגולת לצומת לוחות הגולגולת (גבחת) חשוף. מסגרת אישית מעוצבת למשקוף מוגדר במקום, עיגול מסומן על הגולגולת מסביב begma דרך חור למשקוף, ואת המוט הוסר באופן זמני.
7. המערכת stereotaxic הוא מכויל על ידי מיקום המחט מדריך על גבחת. חור 5 מ"מ הוא קדח לתוך הגולגולת במקום המסומן לבין עצם מוסר, לחשוף את המוח. טבעת דקה של מרק ממוקם סביב הפתח בגולגולת כדי ליצור חותם סביב החור למשקוף, המהווה לאפס למקומו.
8. אם החיה כבר בשעה מטוס יציבה של הרדמה במשך זמן מה, הוא מוזרק עם שיתוק על מנת למנוע תנועות עיניים במהלך איסוף הנתונים. לאחר נשימה עוצר את החיה מאוורר מכאני. תוכנית אישית מסלולים פרמטרים פיזיולוגיים אוורור לאורך כל הניסוי מודיע הנסיין אם הפיצוי פעולה נדרשת כל הפרמטרים צריכים לצאת החוצה רמות נורמליות.
9. מחט המדריך הוא backloaded עם אלקטרודת טונגסטן והוריד לתוך המוח. לאחר החדירה למוח החור למשקוף מלא אגר (לא מוצג), ואת הרכבה Microdrive הוא הידק את המוט על יציבות מכנית. אלקטרודה טונגסטן ואז הוא מתקדם לאט לאט (2μm/sec) את המחט עד קצה מדריך הוא כ 8-9 מ"מ מתחת לגולגולת, שבה התצלובת האופטית ממוקם.
10. רכבות ספייק השייכים לתאי הגנגליון ברשתית מזוהים תגובתם קלט חזותי. עם בידוד של סיבים אופטיים יחיד בשטח פתוח של התא רשמה ממופה במרחב החזותי ומאפיינים בתשובתה מאופיינים עם gratings נסחף או דפוסים חזותיים אחרים בעלי עניין. יציבות המערכת מאפשרת יחיד יחידת הקלטות של כמה שעות ^3.

חומרים

למבוגרים בראון, נורבגיה חולדות (250, 400) נרכשו מהספק מסחרי שוכנו תחת מחזור מוסדר אור / חושך (12/12). הרדמה הושרה עם זריקה intraperitoneal של hydrochloride קטמין ו xylazine (70 ו - 2 מ"ג / ק"ג, בהתאמה, הנרי שיין Inc) ומתוחזק למשך experiment עם עירוי תוך ורידי של קטמין ו xylazine (30 ו - 1 מ"ג / ק"ג / שעה) מעורבב עם דקסטרוז, מלוחים, ו triethiodide gallamine (40 מ"ג / ק"ג / שעה, פישר Inc) באמצעות קטטר (0.13mm OD, חלקים קטנים Inc ) בעורק הירך הימני. Gallamine נכלל התערובת לשתק את תנועות עיניים. קצב עירוי של המשאבה (WPI Inc) הותאם לפי הצורך כדי לשמור על מטוס יציבה של הרדמה כפי שהוערכו על ידי קצב הלב ואת לחץ הדם השונות. לאחר שיתוק, החיה היה מאוורר מכאני (הרווארד Apparatus, דגם 683) דרך צינורית לקנה הנשימה על 60-80 נשימות / דקה (2cc נפח), עם שיעור מותאם לפי הצורך כדי לשמור על הקצה גאות CO ₂ נמדד עם קו- capnometer (Novametrix Inc, דגם 710Sp) על 30%. טמפרטורת הגוף היה מוסדר באמצעות מערכת בקרה homeothermic שמיכה (הרווארד Apparatus Inc). טמפרטורת הגוף, סוף הגאות CO _2, קצב הלב, לחץ דם נוטרו באופן רציף לאורך כל הניסוי באמצעות תוכנת LabVIEW. גירויים חזותיים הוצגו על Multiscan סוני 17e צג CRT (ממוצע בהיקות של 30 cd / m ²⁾ פועל ב 100 הרץ עם רזולוציה של 800x600 פיקסלים. רכישת נתונים פלט לפקח נשלטו עם תוכנות מותאמות אישית נכתב Matlab ו LabVIEW בשילוב עם מעבד תמונה ווידאו (Cambridge Research Systems Inc, Bits + +) ואת ארגז הכלים Psychophysics ^4. בעלי חיים הנצפים התצוגה גירוי (40.4 x 30.2 ס"מ) במרחק של 16.5cm דרך עדשות מגע (Ocular מכשירים Inc), והפתרון עיניים יושמה במהלך הניסוי מעת לעת כדי לשמור על עיניים לחות. שדה הראייה נגיש גירוי היה מוגדל על ידי הרכבה להפוך את החיה במנגנון stereotaxic (Stoelting Co) 14cm מוגבה מעל פני השולחן צף (TMC Inc) ואת הגדרת לפקח על מזחלת אישית מעוצבת שזז על השולחן יחד ± 100 מעלות קשת על האף. זה בתנאי שדה להציג repositionable שנמשכה 60 מעלות מעל 35 מעלות מתחת לגובה העיניים ± 42 מעלות רוחבית ממרכז המסך. Electodes טונגסטן היו מפוברקות עם חוט המתקבל חלקים קטנים Inc אישית זכוכית בורוסיליקט המתקבל פרידריך דימוק בע"מ micropippete תקן חולץ (סאטר מכשירים, דגם P-97) שימש לעצב את קצה של כוס. הבוחן עכבה אלקטרודה נרכש מ-Bak אלקטרוניקה. אלקטרודות היו מתקדמים עם Microdrive ממונע המערכת (Newport Inc, StepperMike). רל אותות עצב הראייה היו מוגבר מסונן עם מגבר multielectrode גבוה עכבה (fhc Inc, X-Cell 3x4). פעימות הלב התגלו עם מאבחן חלון (WPI Inc, דגם 121). פעולה פוטנציאלים עצב התגלו זמן חותמת עם רזולוציה 0.1ms על ידי עלייה דיגיטלי מאבחן (fhc Inc, APM). מאבחן ספייק היתה מגודרת על ידי אות ההדק מהמעבד וידאו התמונה כך פעמים ספייק ננעלו לגירוי.

Discussion

הקלטות סיבים אופטיים הם גישה אטרקטיבית לטיפול ניסיוני שאלות על קידוד מידע הילוכים הרשתית המצריכים עין כנן. יתר על כן, תכונות האיתות של שתי העיניים ניתן ללמוד במצב פיזיולוגי כמעט זהה אם את האלקטרודה ממוקמת ב התצלובת הראייה או מערכת שבה הפעילות של ושילבה שוב ושוב את סיבי עצב הראייה יכול להיות מוקלט עם חדירת אלקטרודה בודדת. הקלטות סיבים אופטיים נפוצים חתול אך לא פופולרי חיות מודלים אחרים המשמשים במחקר חזון, כגון מכרסמים, אולי בזכות גודלם הקטן. ניסינו מגוון של אלקטרודות המסחרי של עכבה חומר דומה, שאף אחד מהם לא היו מצליחים להרים פעילות סיב יחיד חולדה, שלא לדבר על הקלטה זה במשך כמה שעות כמו שלנו יכול אלקטרודות. משמעות הדבר היא כי הגיאומטריה מסוים של האלקטרודות שלנו, אשר יש קצה ארוכה, חדה לעומת קצה קהה רחב של מטרות מסחריות טיפוסי, חשוב בידוד אמין ויציב של תא גנגליון רכבות האקסון ספייק. בנוסף מראה כיצד לפברק אלקטרודות אלה, אנו ממחישים מערכת אישית מעוצבת שלנו stereotaxic עבור במחקר vivo neurophysiological חזותית. המערכת בנויה על מנת להגן על microelectrode עכבה גבוהה מן רטט סביבתיים מרעש אלקטרומגנטית. זה קריטי עבור הקלטה הפוטנציאלים פעולה קטן המיוצר על ידי אקסונים (לעומת גופי התא) לתקופה ממושכת של זמן, במיוחד עם צג המחשב בעמדה הסמוכה. היא עושה זאת עם יציבות יוצאת דופן אות לרעש יחס, עם זמני הקלטה אופייני שעה או יותר ורמות רעש בסדר גודל של עשרות מיקרוולטים. תכונות אלו הופכות את ההתקנה שימושית במיוחד עבור החוקרים חזון במטרה להקליט in vivo של סיבי עצב של הרשתית או אזורים אחרים במוח.