एकल इकाई Vivo में चूहा के ऑप्टिक Chiasm से रिकॉर्डिंग

Summary

आँख से रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं कार्रवाई क्षमता के दृश्यों के साथ मस्तिष्क के लिए दृश्य जानकारी प्रेषित. यहाँ, हम प्रदर्शन कैसे एकल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं की कार्रवाई क्षमता रिकॉर्ड

Abstract

दृश्य दुनिया के बारे में सूचना रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल axons कि ऑप्टिक तंत्रिका बनाने में कार्रवाई क्षमता के दृश्यों में मस्तिष्क के लिए फैलता है.

Protocol

भाग मैं: टंगस्टन में ग्लास इलेक्ट्रोड का निर्माण

1. एक ग्रेफाइट रिंग सोडियम नाइट्रेट (0.71g/mL) और पोटेशियम हीड्राकसीड (0.34g/mL) ¹ पानी में भंग का एक केंद्रित समाधान के साथ भरा बीकर में रखा है, और बीकर एक संशोधित सिलाई मशीन की सिलाई हाथ के नीचे रखा जाता है .
2. टंगस्टन तार (0.5mm व्यास, 6cm लंबाई) इतना है कि यह आंशिक रूप से समाधान में डूब जाता है (1-2cm) सिलाई हाथ करने के लिए टेप है.
3. 2V टंगस्टन तार के पार सिलाई हाथ और ग्रेफाइट की अंगूठी के लिए एक नकारात्मक नेतृत्व करने के लिए एक सकारात्मक नेतृत्व संलग्न द्वारा लागू कर रहे हैं.
4. सिलाई मशीन चालू है और टंगस्टन का तार repetitively समाधान में 2 मिनट है, जो electrolytically एक तेज बिंदु करने के लिए धातु etches के लिए 4Hz ~ की दर में डूबा हुआ है.
5. etched के तार एक मैनुअल micromanipulator और शाफ्ट के साथ एक गिलास (0.25mm आयुध डिपो, 0.175mm आईडी) पिपेट एक गिलास खींचने के साथ एक 1mm टिप करने के लिए खींच के सूक्ष्म मार्गदर्शन (40x बढ़ाई) के तहत गठबंधन बिंदु पर रखा गया है. तार सम्मिलन के दौरान आंदोलन को रोकने के लिए, कांच अस्थायी रूप से पोटीन के साथ खुर्दबीन चरण के लिए सुरक्षित है.
6. तार ध्यान से कांच के unpulled अंत में उन्नत है, शाफ्ट के नीचे, और 1μm खोलने के माध्यम से कांच का एक छोटा सा टुकड़ा के लिए रवाना हो वीडियो में टिप को तोड़ने, गिलास में टंगस्टन का एक तंग फिट का संकेत देखा है. तार 5-10mm के आसपास चूहे ऑप्टिक फाइबर रिकॉर्डिंग के लिए टिप से परे का विस्तार करना चाहिए.
7. कांच के unpulled अंत Cyanoacrylate लागू किया जाता है और सख्त के बाद विद्युत प्रतिबाधा मापा है, जहां 1MΩ इलेक्ट्रोड आमतौर पर सबसे अच्छा काम है.

भाग द्वितीय: Stereotaxic सेटअप और स्पाईक ट्रेन रिकॉर्डिंग

1. उत्तेजना प्रदर्शन प्रणाली वीडियो में stereotaxic और स्थिति और मस्तिष्क में इलेक्ट्रोड को कम करने के लिए तंत्र Microdrive के साथ सचित्र है.
2. रेटिना स्पाइक ट्रेन रिकॉर्डिंग प्रदर्शन चूहे anesthetized और बाद में झोले के मारे हुए है. मानक प्रक्रियाओं (नहीं) सचित्र दवा वितरण और पक्षाघात के दौरान एक tracheal (वाई - ट्यूब) यांत्रिक वेंटीलेशन के लिए प्रवेशनी के लिए एक ऊरु नस प्रवेशनी के सर्जिकल प्रविष्टि के लिए उपयोग किया जाता है. प्रयोगों पशुओं के लिए टर्मिनल हैं.
3. तैयारी प्रक्रियाओं के बाद, पशु हीटिंग कंबल पर रखा है और सिर stereotaxic स्थिति में तय है, के रूप में ^चूहे मस्तिष्क एटलस 2 द्वारा परिभाषित कान और दांत सलाखों के साथ.
4. गुदा जांच डाला जाता है, जो एक homeothermic नियंत्रण इकाई है कि 37 में शरीर का तापमान बनाए रखता है डिग्री सेल्सियस हीटिंग कंबल के माध्यम से नियंत्रण
5. धातु सुई के रूप में इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम और मॉनिटर दिल की दर को मापने के सुराग उपयोग किया जाता है.
6. त्वचा खोपड़ी के शीर्ष पर खोला है और खोपड़ी प्लेटों के चौराहे (bregma) अवगत कराया है. एक कस्टम डिजाइन फ्रेम क्रॉसबार जगह में सेट कर दिया जाता है, एक चक्र begma आसपास खोपड़ी पर क्रॉसबार में एक छेद के माध्यम से चिह्नित है, और क्रॉसबार अस्थायी रूप से हटा दिया जाता है.
7. stereotaxic प्रणाली bregma पर गाइड सुई स्थिति द्वारा calibrated है. एक 5 मिमी छेद खोपड़ी में चिह्नित स्थान पर drilled है और हड्डी हटाया, मस्तिष्क को उजागर. खोपड़ी में खुलने के आसपास पोटीन के एक पतली अंगूठी क्रॉसबार है, जो जगह में रीसेट है में छेद के चारों ओर एक मुहर के रूप में रखा गया है.
8. यदि जानवर संज्ञाहरण के एक स्थिर विमान पर थोड़ी देर के लिए किया गया है, यह झोले के मारे इंजेक्शन के साथ है, डेटा संग्रह के दौरान आँख आंदोलनों को रोकने के क्रम में. साँस लेने के बाद बंद हो जाता है जानवर यंत्रवत् हवादार है. एक कस्टम प्रोग्राम प्रयोग भर में वेंटिलेशन और शारीरिक मापदंडों पटरियों और experimenter बताते हैं अगर प्रतिपूरक कार्रवाई की जरूरत है कोई पैरामीटर सामान्य स्तर के बाहर जाना चाहिए.
9. गाइड सुई टंगस्टन इलेक्ट्रोड के साथ backloaded है और मस्तिष्क में उतारा. मस्तिष्क पैठ क्रॉसबार छेद के बाद अगर () नहीं दिखाया के साथ भरा है, और Microdrive विधानसभा यांत्रिक स्थिरता के लिए क्रॉसबार clamped है. टंगस्टन इलेक्ट्रोड है तो धीरे गाइड सुई बाहर उन्नत (2μm/sec) जब तक टिप नीचे खोपड़ी, जहां ऑप्टिक chiasm स्थित है 8-9mm के बारे में है.
10. रेटिनल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं से संबंधित स्पाईक गाड़ियों दृश्य इनपुट करने के लिए उनकी प्रतिक्रिया द्वारा पहचाने जाते हैं. एक एकल ऑप्टिक फाइबर के अलगाव होने पर दर्ज सेल के ग्रहणशील क्षेत्र दृश्य अंतरिक्ष में मैप किया जाता है और अपनी प्रतिक्रिया गुण बहती gratings या ब्याज की अन्य दृश्य पैटर्न के साथ विशेषता है. प्रणाली की स्थिरता कई ³ ​​घंटे की एकल इकाई रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देता है .

माल

वयस्क ब्राउन नॉर्वे चूहों (250 400g) एक वाणिज्यिक विक्रेता से खरीदे गए थे और एक विनियमित (12/12) / प्रकाश अंधेरे चक्र के तहत रखे. संज्ञाहरण ketamine हाइड्रोक्लोराइड और xylazine (70 और 2 मिलीग्राम / किग्रा, क्रमशः, हेनरी Schein इंक) के एक intraperitoneal इंजेक्शन के साथ प्रेरित किया गया था और अनुभव की अवधि के लिए बनाए रखाiment इंक ketamine और xylazine की एक अंतःशिरा निषेचन (30 और 1 मिलीग्राम / किलो / घंटा) dextrose, नमक के साथ मिश्रित है, और gallamine triethiodide (40 मिलीग्राम / किलो / घंटा, फिशर इंक) (0.13mm आयुध डिपो, लघु पार्ट्स एक कैथेटर के माध्यम से के साथ सही और्विक शिरा में). Gallamine आँख आंदोलनों को पंगु बना मिश्रण में शामिल है. पंप (डब्ल्यूपीआई इंक) के जलसेक दर के रूप में संज्ञाहरण के एक स्थिर विमान को बनाए रखने के रूप में दिल की दर और रक्तचाप परिवर्तनशीलता द्वारा मूल्यांकन की जरूरत समायोजित किया गया. पक्षाघात के बाद, पशु यंत्रवत् में 60-80 साँस / मिनट (2cc मात्रा) पर एक tracheal प्रवेशनी के माध्यम से किया गया था (हार्वर्ड उपकरण, मॉडल 683) हवादार, अंत बनाए रखने के लिए आवश्यक के रूप में _{समायोजित} दर के साथ ज्वारीय सीओ 2 एक में लाइन के साथ मापा capnometer (Novametrix इंक, 710Sp मॉडल) 30% पर. शारीरिक तापमान homeothermic कंबल नियंत्रण प्रणाली (हार्वर्ड उपकरण इंक) के माध्यम से विनियमित किया गया था. शारीरिक तापमान, अंत ज्वार ₂ सीओ, हृदय की दर और रक्तचाप लगातार एक LABVIEW प्रोग्राम द्वारा प्रयोग के दौरान निगरानी की गई . दृश्य उत्तेजनाओं एक सोनी Multiscan 17e CRT (30 सीडी / ² मीटर के luminance मतलब) मॉनिटर 800x600 पिक्सल के एक संकल्प के साथ 100 हर्ट्ज पर चल रहा है पर प्रस्तुत किए गए. डाटा अधिग्रहण और मॉनिटर उत्पादन एक वीडियो छवि प्रोसेसर (कैंब्रिज रिसर्च सिस्टम्स इंक, बिट्स + +) और Psychophysics ⁴ साधन के साथ संयोजन के रूप में Matlab और LabVIEW में लिखा कस्टम सॉफ्टवेयर के साथ नियंत्रित किया गया. जानवर 16.5cm संपर्क लेंस (नेत्र इंस्ट्रूमेंट्स इंक) के माध्यम से की दूरी पर उत्तेजना प्रदर्शन (40.4 x 30.2 सेमी) देखी गयी, और नेत्र समाधान आंखें नम रखने के लिए प्रयोग के दौरान समय - समय पर लागू किया गया था. दृश्य उत्तेजना को सुलभ क्षेत्र के एक stereotaxic उपकरण में पशु बढ़ते (Stoelting सह) (टीएमसी इंक) एक अस्थायी मेज की सतह से ऊपर ऊंचा 14cm और कस्टम डिजाइन एक स्लेज कि साथ मेज पर चले गए पर निगरानी की स्थापना रिवर्स द्वारा maximized किया गया था एक ± नाक के बारे में 100 डिग्री आर्क. यह एक repositionable प्रदर्शन क्षेत्र है कि 60 डिग्री ऊपर और 35 डिग्री आँख के स्तर के नीचे और ± 42 डिग्री पार्श्व मॉनिटर के केंद्र से विस्तारित प्रदान की है. टंगस्टन electodes लघु पार्ट्स इंक और कस्टम borosilicate फ्रेडरिक और Dimmock इंक एक मानक micropippete डांड़ी (Sutter उपकरण, मॉडल P-97) से प्राप्त कांच से प्राप्त तार के साथ गढ़े थे गिलास टिप आकार के लिए इस्तेमाल किया गया. इलेक्ट्रोड प्रतिबाधा परीक्षक बक - इलेक्ट्रॉनिक्स से खरीदा गया था. इलेक्ट्रोड एक motorized Microdrive सिस्टम (न्यूपोर्ट इंक, StepperMike) के साथ उन्नत किया गया है. इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम और ऑप्टिक तंत्रिका संकेतों प्रवर्धित थे और एक उच्च इनपुट प्रतिबाधा multielectrode प्रवर्धक (fhc इंक, एक्स - 3x4 सेल) के साथ फ़िल्टर्ड. दिल धड़कता है एक खिड़की discriminator (डब्ल्यूपीआई इंक, 121 मॉडल) के साथ पाया गया. तंत्रिका कार्रवाई क्षमता का पता लगाया गया और समय मोहरदार 0.1ms संकल्प के साथ एक डिजिटल कील discriminator (fhc इंक, एपीएम) द्वारा. स्पाइक discriminator स्पाइक बार इतना है कि प्रोत्साहन के लिए बंद कर दिया गया वीडियो छवि प्रोसेसर से एक ट्रिगर संकेत द्वारा gated था.

Discussion

ऑप्टिक फाइबर रिकॉर्डिंग रेटिना जानकारी एन्कोडिंग और संचरण है कि एक अक्षुण्ण आंख की आवश्यकता के बारे में प्रयोगात्मक सवाल को संबोधित करने के लिए एक आकर्षक दृष्टिकोण हैं. इसके अलावा, लगभग एक ही शारीरिक राज्य में दोनों आँखों के संकेत गुणों का अध्ययन किया जा सकता है अगर इलेक्ट्रोड ऑप्टिक chiasm या पथ जहां पार और uncrossed ऑप्टिक तंत्रिका तंतुओं की गतिविधि एक एकल इलेक्ट्रोड पैठ के साथ दर्ज किया जा सकता है है में तैनात है. ऑप्टिक फाइबर रिकॉर्डिंग बिल्ली में आम हैं, लेकिन अन्य लोकप्रिय जानवरों दृष्टि अनुसंधान में इस्तेमाल किया जैसे मॉडल, कृन्तकों, शायद उनके छोटे आकार के कारण नहीं. हम इसी तरह प्रतिबाधा और सामग्री के वाणिज्यिक इलेक्ट्रोड, जिनमें से कोई भी चूहे में एक फाइबर गतिविधि उठा पर सफल रहे थे की एक किस्म की कोशिश की है, अकेले इसे हमारे इलेक्ट्रोड कर सकते हैं जैसे कई घंटे के लिए रिकॉर्डिंग. इसका मतलब है कि हमारे इलेक्ट्रोड है, जो एक लंबे, तेज टिप के रूप में ठेठ वाणिज्यिक लोगों की एक विस्तृत कुंद टिप करने के लिए विरोध किया है के विशेष ज्यामिति नाड़ीग्रन्थि सेल अक्षतंतु स्पाइक गाड़ियों के विश्वसनीय और स्थिर अलगाव के लिए महत्वपूर्ण है. दिखा रहा है कैसे बनाना इन इलेक्ट्रोड के अलावा, हम vivo में दृश्य neurophysiological अनुसंधान में के लिए हमारे कस्टम डिजाइन stereotaxic प्रणाली वर्णन. प्रणाली के लिए पर्यावरण और कंपन से विद्युत शोर से उच्च प्रतिबाधा microelectrode की रक्षा का निर्माण किया है. इस छोटे से कार्रवाई क्षमता समय की एक लम्बी अवधि के लिए axons (के रूप में सेल निकायों की तुलना में) द्वारा उत्पादित रिकॉर्डिंग के लिए एक कंप्यूटर के पास तैनात मॉनिटर के साथ, विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. यह एक घंटे या अधिक और microvolts के दसियों के आदेश पर शोर के स्तर के विशिष्ट रिकॉर्डिंग समय के साथ असाधारण स्थिरता और संकेत से शोर अनुपात के साथ ऐसा करता है. इन सुविधाओं सेटअप विशेष रूप से दृष्टि रेटिना या अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों के तंत्रिका तंतुओं से vivo में रिकॉर्ड लक्ष्य शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी बनाते हैं.