シングルユニット in vivoで録音

Summary

網膜神経節細胞は、眼からの活動電位の配列との脳に視覚情報を送信する。ここで、我々は、単一の神経節細胞の活動電位を記録する方法を示しています

Abstract

視覚的な世界に関する情報は、視神経を構成する網膜神経節細胞の軸索における活動電位のシーケンスで脳に伝達される。

Protocol

パートI：タングステンインガラス電極の作製

1. グラファイトリングは、硝酸ナトリウム（0.71g/mL）と水¹に溶解した水酸化カリウム（0.34g/mL）の濃縮液で満たされたビーカーに入れられ、ビーカーが変更されたミシンの縫製腕の下に置かれている。
2. それは部分的に浸漬されるようにタングステン線（0.5ミリメートルの直径、6センチメートル長さ）は溶液中で（1〜2センチメートル）ミシンアームにテープで固定されています。
3. 2Vは、グラファイトリングに縫製アームと負のリード線にプラス側のリード線を取り付けることによりタングステンワイヤを介して適用されます。
4. ミシンがオンになっているとタングステンワイヤが電解鋭いポイントに金属をエッチングする2分、のための〜4Hzの速度で溶液中に繰り返し浸漬する。
5. エッチングされたワイヤは、マニュアルマニピュレータ及びガラスピペット（0.25ミリメートルOD、0.175ミリメートルID）ガラスの引き手と1mmの先端に引っ張らのシャフトを持つ微細な指導（40倍の倍率）の下に整列点に配置されます。電線挿入中に動かないようにするため、ガラスは、一時的にパテを顕微鏡ステージに固定されている。
6. ワイヤはシャフトの下、ガラスのunpulled最後に慎重に進んでおり、1μmの開口部を通してガラスの小片は、ガラス中のタングステンのタイトなフィットを示し、ビデオの先端を絶つために見られている。ワイヤーは、ラット光ファイバー録音用先端を越えて5〜10ミリメートルの周りに拡張する必要があります。
7. シアノアクリレートは、ガラスのunpulled最後に適用され、硬化後の電気インピーダンスを測定して、1MΩの電極は、一般的に最も効果的場所。

パートII：定位セットアップとスパイクトレインレコーディング

1. 刺激の表示システムは、脳に電極を配置し、低下させるための定位固定装置とマイクロドライブと一緒に、ビデオに示されている。
2. 網膜スパイク列の記録を実行するためにラットを麻酔し、後に麻痺です。標準的な手順は、（図示せず）薬物送達および麻痺の間に機械的な換気のために気管（Y -チューブ）カニューレのための大腿静脈にカニューレの外科的挿入のために使用されています。実験は、動物用の端子です。
3. 準備手続の後、動物は加熱毛布の上に配置され、頭部は耳と歯のバーで、としてラット脳アトラス²で定義されて、定位位置に固定されています。
4. 直腸プローブは37℃体温を維持する恒温制御ユニット℃に介して加熱毛布を制御する、挿入される
5. 金属針は、心電図やモニターの心拍数を測定するためにリード線として使用されます。
6. 皮膚は、頭蓋骨の上に開かれ、頭蓋骨のプレートの交点（ブレグマ）が公開されています。カスタム設計されたクロスバーのフレームを所定の位置に設定されている、円はクロスバーの穴に通しbegma周り頭蓋骨に記されています、とクロスバーは、一時的に削除されます。
7. 定位システムはブレグマ上のガイドの針を配置することによって較正されています。 5 mmの穴が著しい場所で頭蓋骨にドリルされ、骨が削除され、脳を露出させる。パテの細いリングが所定の位置にリセットされたクロスバー、の穴周りのシールを形成するために頭蓋骨の開口部の周りに置かれます。
8. 動物は、しばらく麻酔の安定した平面になっている場合、それはデータ収集時に目の動きを防ぐために、麻痺を注射されています。呼吸が停止した後、動物は機械的に換気される。カスタムプログラムでは、実験を通して換気と生理学的パラメータを追跡し、任意のパラメータが正常なレベルの外に行く必要の補償作用が必要な場合は実験者に知らせます。
9. ガイド針はタングステン電極とbackloadedと脳に低下する。脳の浸透後にクロスバーの穴は、寒天（図示せず）が充填されている、とマイクロドライブのアセンブリは、機械的安定性のためのクロスバーにクランプされます。先端が視交叉が配置されている頭蓋骨、下は約8〜9ミリメートルになるまで、タングステン電極は、ガイド針アウト（2μm/sec）その後徐々に高度です。
10. 網膜神経節細胞に属するスパイクは、視覚入力への応答によって識別されます。単一の光ファイバの分離時に記録された細胞の受容野は、視覚的な空間にマッピングされ、その応答特性は、漂流格子や関心のある他の視覚的なパターンで特徴付けられる。システムの安定性は、数時間の³つのユニットの録音が可能になります。

材料

成人ブラウンノルウェーラット（250〜400グラム）が商用ベンダーから購入し、規制（12/12）明/暗サイクル下で飼育した。麻酔は塩酸ケタミンとキシラジン（70、2 mg / kgを、それぞれ、ヘンリーシャイン社）の腹腔内注射で誘導とexperの期間中維持されたカテーテルを通して静脈内ブドウ糖、生理食塩水と混合ケタミンとキシラジンの投与（30及び1 mg / kg / hrの）、およびガラミンのtriethiodide（40 mg / kg体重/時、フィッシャー社）（0.13ミリメートルOD、スモールパーツ社とiment右大腿静脈で）。ガラミンは、目の動きを麻痺させる混合物に含まれています。心拍数と血圧の変動性によって評価される麻酔の安定した平面を維持するために必要なポンプ（WPI社）の注入速度を調節した。麻痺した後、動物は機械的にインラインで測定した呼気終末CO _2を維持するために、必要に応じて調整率で、60から80呼吸/分（2ccの体積）で気管カニューレを介して（ハーバード装置、モデル683）換気された30％でカプノメーター（ノバメトリックス社、モデル710Sp）。体温は恒温毛布の制御システム（ハーバード装置株式会社）を介して調節した。体温、呼吸終期のCO _2、心拍数、血圧を連続的にLabVIEWのプログラムで実験を通してモニターした。視覚刺激は、800x600ピクセルの解像度で100Hzで動作してソニーのマルチスキャン17E CRTモニター（30 cd / m ²の輝度を意味する）に発表されました。データ収集とモニター出力は、ビデオイメージプロセッサ（ケンブリッジリサーチシステム株式会社、ビット+ +）と心理物理学ツールボックス⁴との組み合わせでMATLABやLabVIEWで記述されたカスタムソフトウェアで制御されていました。動物は、コンタクトレンズ（眼インスツルメンツ社）を通じて、16.5センチメートルの距離で刺激ディスプレイ（40.4 X 30.2センチメートル）表示、および点眼液は眼の潤いを保つために、実験中に定期的に適用されました。刺激へのアクセス可能な視野は、フローティングテーブルの表面（TMC社）上記の定位固定装置（CoをStoelting）上昇14センチメートルで動物をマウントし、一緒にテーブルの上に移動し、カスタム設計のそりの上にモニターを設定し、逆により最大化されていた鼻は約± 100 °の円弧。これは60度を超えると35度目の高さ以下と± 42度横方向にモニタの中心からの延長repositionable表示フィールドを提供する。タングステンelectodesは、ガラスチップを形成するために使用された小型部品株式会社とフリードリヒとディモック社標準micropippeteプーラー（サッタインスツルメンツ、モデルP - 97）から得られたカスタムホウケイ酸ガラスから得られる線で作製した。電極インピーダンスのテスターは、朴エレクトロニクスから購入した。電極は、電動マイクロドライブシステム（ニューポート社、StepperMike）で進めていた。心電図および視神経の信号は、高入力インピーダンスの多電極アンプ（FHC社、X -セル× 4）で増幅し、ろ過した。ハートビートは、ウィンドウのディスクリミネータ（WPI社、モデル121）で検出した。神経の活動電位は、デジタルスパイク弁別（FHC社、APM）で0.1msの分解能で検出し、タイムスタンプが付けられた。スパイクディスクリミネータは、スパイク時間が刺激にロックされていたようにビデオ画像プロセッサからのトリガ信号によってゲートだった。

Discussion

光ファイバーの録音は、そのまま目を必要とする網膜情報の符号化と伝送に関する実験的な質問に対処するための魅力的なアプローチです。電極が交差し、非クロス視神経線維の活動が単一の電極への浸透で記録することができます視交叉や消化管に配置されている場合、また、両眼のシグナル伝達特性は、ほぼ同じ生理的な状態で検討することができます。光ファイバーの録音は、げっ歯類のようなビジョンの研究で使用されている他の人気の動物モデルでそれらの小さいサイズに多分により猫に共通のものですが、。我々は、ラットにおける単繊維の活動を拾いに成功した、どれも同じようなインピーダンスと材料の商業電極、様々な試みている、私たちの電極のようないくつかの時間ができるためにそれを記録するどころか。これは、典型的な商用のものの広い丸い先端とは対照的に長く、鋭い先端を持っている私たちの電極、、の特定の幾何学は神経節細胞軸索スパイクの信頼性と安定した単離のために重要であることを意味します。これらの電極を作製する方法を示すに加えて、我々は、 生体の視覚神経生理学的研究のために私たちのカスタム設計の定位システムを示しています。システムは、環境振動から、電磁ノイズからの高インピーダンスの微小電極を保護するために構築されます。これは、特に近くに位置するコンピュータのモニタで、長期間の軸索（のような細胞体に比べて）によって生成された小さな活動電位を記録するために重要です。それは数十マイクロボルトのオーダーの時間以上と騒音レベルの代表的な記録時間で、優れた安定性と信号対雑音比でそうする。これらの機能は、網膜や他の脳領域の神経線維から生体内で録音することを目的とビジョンの研究者のためのセットアップは特に有用です。