Single-unit In vivo Opnamen van de Optic chiasma van de Rat

Summary

Retinale ganglion cellen fungeren visuele informatie van het oog naar de hersenen met sequenties van actiepotentialen. Hier laten we zien hoe de actie mogelijkheden van enkele ganglioncellen opnemen

Abstract

Informatie over de visuele wereld wordt doorgegeven aan de hersenen in sequenties van actiepotentialen in retinale ganglion cel axons die deel uitmaken van de oogzenuw.

Protocol

Deel I: Fabricage van Tungsten-in-glaselektroden

1. Een grafiet ring wordt geplaatst in een bekerglas gevuld met een geconcentreerde oplossing van natriumnitraat pa (0.71g/mL) en kaliumhydroxide (0.34g/mL) opgelost in water ^1, en ​​de beker is geplaatst onder de arm naaien van een gemodificeerde naaimachine .
2. Wolfraam draad (0,5 mm diameter, 6 cm lengte) is geplakt is aan de vrije arm, zodat het gedeeltelijk is ondergedompeld (1-2cm) in oplossing.
3. 2V worden toegepast in de wolfraam draad door het aanbrengen van een positieve draad aan het naaien arm en een negatieve draad op het grafiet ring.
4. De naaimachine is ingeschakeld en de wolfraam draad is herhaaldelijk ondergedompeld in oplossing met een snelheid van ~ 4Hz gedurende 2 min, wat elektrolytisch het metaal etsen om een ​​scherpe punt.
5. De geëtste draad is geplaatst op een handleiding micromanipulator en het punt lijn bij microscopisch begeleiding (40x vergroting) met de as van een glazen pipet (0.25mm OD, 0.175mm ID) getrokken om een ​​1mm tip met een glas trekker. Om te voorkomen dat beweging tijdens draad inbrengen, is het glas tijdelijk bevestigd aan de microscoop podium met stopverf.
6. De draad wordt zorgvuldig gevorderd in de unpulled einde van het glas, in de schacht, en door de opening 1 uM Een klein stukje glas wordt gezien af ​​te breken de punt in de video, wat wijst op een strakke pasvorm van de wolfraam in het glas. De draad moet zich uitstrekken rond 5-10mm boven de tip voor rat glasvezel opnames.
7. Cyanoacrylaat wordt toegepast op de unpulled einde van het glas en na verharding van de elektrische impedantie wordt gemeten, waar 1MΩ elektroden over het algemeen het beste werken.

Deel II: stereotaxische Setup en Spike Train Recordings

1. De stimulans display is geïllustreerd in de video, samen met de stereotaxische apparatuur en microdrive voor de positionering en het verlagen van de elektrode in de hersenen.
2. Voor het uitvoeren van het netvlies spike train-opnamen van de rat is verdoofd en later verlamd. Standaard procedures (niet afgebeeld) worden gebruikt voor chirurgische het inbrengen van een femorale ader canule voor drug delivery en een tracheale (Y-buis) canule voor de mechanische ventilatie tijdens verlamming. De experimenten zijn terminal voor het dier.
3. Na de voorbereidende procedures, wordt het dier op de verwarming deken en het hoofd is bevestigd in stereotaxische positie, zoals gedefinieerd door de hersenen van de rat atlas ^2, met oor en tand bars.
4. De rectale sonde wordt ingebracht, welke controles de verwarming deken via een homeothermic controle-eenheid die de lichaamstemperatuur houdt op 37 ° C.
5. Metalen naald worden gebruikt als leidt het meten van de elektrocardiogram en monitoren hartslag.
6. De huid is geopend op de top van de schedel en het snijpunt van de schedel platen (bregma) is blootgesteld. Een op maat ontworpen crossbar frame is opgezet, is een cirkel aangegeven op de schedel rond begma door een gat in de lat, en de doellat is tijdelijk verwijderd.
7. Het stereotaxische systeem wordt gekalibreerd door het positioneren van de gids naald boven bregma. Een 5-mm gat is geboord in de schedel op de aangegeven locatie en het bot wordt verwijderd, waardoor de hersenen. Een dunne ring van putty is geplaatst rond de opening in de schedel van een afdichting rond het gat in de lat, die wordt teruggezet op zijn plaats te vormen.
8. Als het dier is in een stabiele vlak van anesthesie voor een tijdje, wordt het geïnjecteerd met verlamde om oogbewegingen te voorkomen tijdens het verzamelen van gegevens. Na de ademhaling stopt het dier is mechanisch geventileerd. Een aangepaste programma tracks ventilatie en fysiologische parameters gedurende het experiment en informeert de onderzoeker indien geen compenserende maatregelen nodig zijn moeten alle parameters te gaan buiten de normale niveaus.
9. De gids naald is backloaded met de wolfraam elektrode en zakken in de hersenen. Na een hersen-penetratie de lat gat wordt gevuld met agar (niet getoond), en de microdrive montage is vastgeklemd aan de lat voor mechanische stabiliteit. De wolfraam-elektrode wordt dan langzaam geavanceerde (2μm/sec) uit de gids naald tot de top is ongeveer 8-9mm onder de schedel, waar het optisch chiasma zich bevindt.
10. Spike treinen die behoren tot retinale ganglioncellen worden geïdentificeerd door hun reactie op visuele input. Bij de isolatie van een enkele optische vezel het receptieve veld van de opgenomen cel is in kaart gebracht in de visuele ruimte en de respons-eigenschappen worden gekenmerkt met dwalende roosters of andere visuele patronen van belangstelling. De stabiliteit van het systeem maakt het mogelijk voor single-unit opnames van enkele uren ^3.

Materialen

Adult Brown-Noorwegen ratten (250-400g) werden gekocht bij een commerciële leverancier en ondergebracht onder een gereglementeerde (12/12) licht / donker-cyclus. Anesthesie werd geïnduceerd met een intraperitoneale injectie van ketamine en xylazine hydrochloride (70 en 2 mg / kg, respectievelijk, Henry Schein Inc) en onderhouden voor de duur van de expertisewilt spelen of experimenteer met een intraveneuze infusie van ketamine en xylazine (30 en 1 mg / kg / uur) gemengd met dextrose, zout, en gallamine triethiodide (40 mg / kg / uur, Fischer Inc) door middel van een katheter (0,13 mm OD, kleine onderdelen Inc ) in de rechter lies. Gallamine is opgenomen in het mengsel van de oogbewegingen te verlammen. De infusiesnelheid van de pomp (WPI Inc) werd aangepast als nodig is om een ​​stabiel vlak van anesthesie te behouden zoals beoordeeld door de hartslag en de bloeddruk variabiliteit. Na de verlamming, was het dier mechanisch geventileerde (Harvard Apparatus, Model 683) via een tracheale canule op 60-80 ademhalingen / min (2cc volume), met de snelheid aangepast als nodig is om te behouden end-tidal CO ₂ gemeten met een in-line capnometer (Novametrix Inc, Model 710Sp) op 30%. De lichaamstemperatuur was geregeld via een homeothermic deken controlesysteem (Harvard Apparatus Inc). Lichaamstemperatuur, end-tidal CO _2, hartslag en bloeddruk werden continu bewaakt het hele experiment van een LabVIEW programma. Visuele stimuli werden gepresenteerd op een Sony Multiscan 17e CRT-monitor (gemiddelde helderheid van 30 cd / m ²⁾ draait op 100 Hz met een resolutie van 800x600 pixels. Data-acquisitie en monitor output werd gecontroleerd met aangepaste software geschreven in Matlab en LabView in combinatie met een video-beeldprocessor (Cambridge Research Systems Inc, Bits + +) en de Psychofysica Toolbox ^4. Het dier zag de stimulus display (40,4 x 30,2 cm) op een afstand van 16,5 cm door contactlenzen (Oculaire Instruments Inc), en oogdruppels werd regelmatig toegepast tijdens het experiment te houden de ogen vochtig. De visuele veld toegankelijk voor stimulatie werd gemaximaliseerd door omgekeerde montage van het dier in een stereotaxische apparaat (Stoelting Co) verheven 14cm boven het oppervlak van een zwevende tafel (TMC Inc) en het instellen van de monitor op een speciaal ontworpen slee die op de tafel bewogen langs een ± 100 graden boog rond de neus. Dit leverde een herpositioneerbare weer te geven veld dat uitgebreid van 60 graden boven en 35-graden onder ooghoogte en ± 42 graden zijdelings van het centrum van de monitor. Wolfraam electodes werden gefabriceerd met draad verkregen uit kleine onderdelen Inc en aangepaste borosilicaatglas verkregen van Friedrich en Dimmock Inc een standaard micropippete trekker (Sutter Instruments, Model P-97) werd gebruikt om het glas tip vorm. De elektrode impedantie tester werd gekocht van Bak-Electronics. Elektroden werden gevorderd met een gemotoriseerd Microdrive-systeem (Newport Inc, StepperMike). Elektrocardiogram en oogzenuw signalen werden versterkt en gefilterd met een hoge ingangsimpedantie multielectrode versterker (FHC Inc, X-Cell 3x4). Hart klopt werden gedetecteerd met een venster discriminator (WPI Inc, Model 121). Nerve actiepotentialen werden ontdekt en de tijd gestempeld met 0,1 ms resolutie door een digitale piek discriminator (FHC Inc, APM). De piek discriminator was gated door een trigger signaal van de video-beeldprocessor, zodat spike tijden waren vergrendeld aan de stimulus.

Discussion

Glasvezel opnames zijn een aantrekkelijke aanpak voor het aanpakken van experimentele vragen over het netvlies informatie codering en verzending van dat een intact oog nodig. Bovendien kan de signalering eigenschappen van beide ogen worden bestudeerd in nagenoeg dezelfde fysiologische toestand als de elektrode is geplaatst in de optische chiasma of luchtwegen waar de activiteit van gekruiste en uncrossed optische zenuwvezels kan worden opgenomen met een enkele elektrode penetratie. Glasvezel-opnamen komen vaak voor bij katten, maar niet in andere populaire dieren modellen die gebruikt worden in de visie van onderzoek, zoals knaagdieren, misschien vanwege hun kleine omvang. We hebben een verscheidenheid aan commerciële elektroden van vergelijkbare impedantie en materiaal, die geen van alle succesvol waren bij het oppakken van enkele vezel activiteit bij ratten geprobeerd, laat staan ​​de opname het voor een aantal uren als onze elektroden kunnen. Dit houdt in dat de specifieke geometrie van onze elektroden, dat een lange, scherpe punt in tegenstelling tot de brede stompe punt van de gebruikelijke commerciële degenen hebben, belangrijk is voor een betrouwbare en stabiele isolatie van ganglion cel axon spike treinen. Naast het laten zien hoe op deze elektroden fabriceren, illustreren we onze speciaal ontworpen stereotaxische systeem voor in-vivo-visuele neurofysiologisch onderzoek. Het systeem is gebouwd om de hoge impedantie micro-elektrode te beschermen tegen trillingen en het milieu tegen elektromagnetische ruis. Dit is essentieel voor het opnemen van de kleine actiepotentialen geproduceerd door axonen (in vergelijking met cellichamen) voor een langere tijd, vooral met een computer monitor in de buurt geplaatst. Zij doet dit met een uitzonderlijke stabiliteit en de signaal-ruisverhouding, met typische opnametijden van een uur of meer en geluidshinder aan de orde van tientallen microvolt. Deze eigenschappen maken de setup vooral nuttig voor onderzoekers visie gericht op het in vivo op te nemen van zenuwvezels van het netvlies of van andere hersengebieden.