Une seule unité In vivo Enregistrements à partir du chiasma optique du Rat

Summary

Cellules ganglionnaires de la rétine transmettent l'information visuelle de l'œil au cerveau avec des séquences de potentiels d'action. Ici, nous montrons comment enregistrer les potentiels d'action des cellules ganglionnaires de simples

Abstract

Informations sur le monde visuel est transmis au cerveau dans les séquences de potentiels d'action dans les axones des cellules ganglionnaires rétiniennes qui forment le nerf optique.

Protocol

Partie I: Fabrication de tungstène-en-verre Électrodes

1. Un anneau de graphite est placé dans un bécher rempli d'une solution concentrée de nitrate de sodium (0.71g/mL) et d'hydroxyde de potassium (0.34g/mL) dissous dans l'eau ^1, et le bécher est placé sous le bras de couture d'une machine à coudre modifiées .
2. Fils de tungstène (0,5 mm de diamètre, longueur 6cm) est enregistrée au bras de couture afin qu'il soit partiellement immergé (1-2cm) en solution.
3. 2V sont appliquées à travers le fil de tungstène en attachant un fil positif à la branche de couture et d'un fil négatif à la bague de graphite.
4. La machine à coudre est allumé et le fil de tungstène est plongé dans une solution de façon répétitive à un taux de ~ 4Hz pendant 2 min, qui grave le métal par électrolyse d'une pointe acérée.
5. Le fil gravé est placé sur un micromanipulateur manuel et les points alignés sous la direction microscopique (grossissement 40x) avec l'arbre d'une pipette en verre (0,25 OD, 0.175mm ID) tiré d'un bout 1mm avec un extracteur de verre. Pour éviter tout mouvement pendant l'insertion de fil, le verre est temporairement fixé à la platine du microscope avec du mastic.
6. Le fil est soigneusement avancés dans l'extrémité unpulled du verre, au fond du puits, et par l'ouverture 1 um Un petit morceau de verre est vu à rompre la pointe dans la vidéo, indiquant un ajustement serré du tungstène dans le verre. Le fil doit s'étendre autour de 5-10mm au-delà de la pointe pour les enregistrements de la fibre optique chez le rat.
7. Cyanoacrylate est appliquée à la fin unpulled du verre et après le durcissement de l'impédance électrique est mesurée, lorsque les électrodes 1MOhm généralement les meilleurs résultats.

Partie II: Configuration stéréotaxique et enregistrements train de Spike

1. Le système d'affichage de relance est illustrée dans la vidéo, avec l'appareil de stéréotaxie et Microdrive pour le positionnement et l'abaissement de l'électrode dans le cerveau.
2. Pour effectuer la rétine enregistrements train de pic le rat est anesthésié et plus tard paralysé. Les procédures standard (non illustrée) sont utilisés pour l'insertion d'une canule chirurgicale veine fémorale pour la livraison de drogue et une trachée (Y-tube) une canule pour la ventilation mécanique pendant la paralysie. Les expériences sont de terminal pour l'animal.
3. Après des procédures préparatoires, l'animal est placé sur la couverture chauffante et la tête est fixe en position stéréotaxique, telle que définie par l'atlas du cerveau de rat ^2, avec l'oreille et bars dent.
4. La sonde rectale est inséré, qui contrôle la couverture chauffante via une unité de contrôle homéothermes qui maintient la température du corps à 37 ° C.
5. Aiguilles métalliques sont utilisés comme conduit pour mesurer l'électrocardiogramme et moniteur de fréquence cardiaque.
6. La peau est ouvert sur le dessus du crâne et l'intersection des plaques crâne (bregma) est exposée. Une trame transversale conçu sur mesure est mis en place, un cercle est marqué sur le crâne autour begma à travers un trou dans la traverse, et la barre transversale est temporairement retiré.
7. Le système de stéréotaxie est calibré par le positionnement de l'aiguille de guidage sur bregma. Un trou de 5 mm est foré dans le crâne à l'endroit marqué et l'os est enlevée, exposant le cerveau. Un mince anneau de mastic est placé autour de l'ouverture dans le crâne pour former un joint autour du trou dans la traverse, qui est remis en place.
8. Si l'animal a été à un avion stable de l'anesthésie pendant un certain temps, il est injecté avec paralytique afin d'empêcher les mouvements des yeux lors de la collecte des données. Après arrêt de la respiration de l'animal est ventilé mécaniquement. Un programme personnalisé pistes paramètres de ventilation et physiologiques à travers l'expérience et l'expérimentateur informe si des mesures compensatoires sont nécessaires devraient tous aller à l'extérieur des paramètres des niveaux normaux.
9. L'aiguille guide est backloaded avec l'électrode de tungstène et descendu dans le cerveau. Après la pénétration du cerveau le trou barre est remplie avec de l'agar (non représenté), et l'assemblée microdrive est serrée sur la barre transversale pour la stabilité mécanique. L'électrode de tungstène est alors lentement avancé (2μm/sec) l'aiguille guide jusqu'à la pointe est d'environ 8-9mm dessous du crâne, où le chiasma optique est situé.
10. Trains de Spike appartenant à des cellules ganglionnaires de la rétine sont identifiés par leur réponse à l'entrée visuelle. Après isolement d'une seule fibre optique le champ récepteur de la cellule enregistrée est mappé dans l'espace visuel et ses propriétés de réponse sont caractérisés avec des réseaux à la dérive ou d'autres motifs d'intérêt visuel. La stabilité du système permet unitaire des enregistrements de plusieurs heures ^3.

Matériaux

Adulte Brown-Norway rats (250-400g) ont été achetés auprès d'un fournisseur commercial et logés sous un réglementée (12/12) cycle lumière / obscurité. L'anesthésie a été induite par une injection intrapéritonéale de chlorhydrate de kétamine et de xylazine (70 et 2 mg / kg, respectivement, Henry Schein Inc) et maintenu pour la durée de l'expertiseiment avec une perfusion intraveineuse de kétamine et de xylazine (30 et 1 mg / kg / h) mélangé avec du dextrose, du sérum physiologique, et triéthiodure gallamine (40 mg / kg / h, Fischer Inc) par un cathéter (0,13 mm OD, petites pièces Inc ) dans la veine fémorale droite. Gallamine est inclus dans le mélange de paralyser les mouvements des yeux. Le débit de perfusion de la pompe (WPI Inc) a été ajusté au besoin pour maintenir un avion stable de l'anesthésie telle qu'évaluée par le rythme cardiaque et variabilité de la pression artérielle. Après la paralysie, l'animal a été ventilé mécaniquement (Harvard Apparatus, modèle 683) à travers une canule trachéale à 60-80 respirations / min (2cc volume), avec le taux ajusté de façon à maintenir en fin d'expiration de CO ₂ mesurées avec une ligne en- capnomètre (Novametrix Inc, modèle 710Sp) à 30%. La température corporelle a été réglementé par un système de contrôle de couverture homéothermes (Harvard Apparatus Inc.) La température du corps, en fin d'expiration de la fréquence cardiaque de CO _2, et la pression artérielle ont été constamment suivis tout au long de l'expérience par un programme LabVIEW. Les stimuli visuels étaient présentés sur un Sony Multiscan 17e moniteur CRT (moyenne de luminance de 30 cd / m ²⁾ fonctionnant à 100 Hz avec une résolution de 800x600 pixels. L'acquisition des données et de sortie de moniteur ont été contrôlés avec un logiciel personnalisé écrit en Matlab et LabView en conjonction avec un processeur d'image vidéo (Cambridge Research Systems Inc, Bits + +) et la boîte à outils Psychophysique ^4. L'animal considéré l'affichage de relance (40,4 x 30,2 cm) à une distance de 16,5 cm grâce à des lentilles de contact (Ocular Instruments Inc), et une solution ophtalmique a été appliquée périodiquement pendant l'expérience de garder les yeux humides. Le champ visuel accessible à la stimulation a été maximisée par montage inversé de l'animal dans un appareil stéréotaxique (Stoelting Co) 14cm élevée au-dessus de la surface d'une table flottante (TMC Inc) et réglage du moniteur sur un traîneau spécialement conçus qui se mouvait sur la table le long un arc de ± 100 ° sur le nez. Cela a fourni un champ d'affichage repositionnable qui s'étendait de 60 degrés au-dessus et 35 ci-dessous deg niveau des yeux et de ± 42 ° latéralement à partir du centre de l'écran. Electodes tungstène ont été fabriqués avec du fil obtenu à partir de petites pièces Inc et personnalisée en verre borosilicate obtenus à partir de Friedrich et Dimmock Inc Une norme micropippete extracteur (Sutter Instruments, modèle P-97) a été utilisé pour la forme la pointe de verre. Le testeur d'impédance d'électrode a été acheté par Bak-Electronics. Les électrodes ont été avancées avec un système motorisé Microdrive (Newport Inc, StepperMike). Électrocardiogramme et les signaux du nerf optique ont été amplifiés et filtrés avec un amplificateur multiélectrodes entrée haute impédance (FHC Inc, X-Cell 3x4). Battements de cœur ont été détectés avec un discriminateur de fenêtre (WPI Inc, modèle 121). Potentiels d'action nerveuses ont été détectés et horodatés avec une résolution 0.1ms par un discriminateur numériques pic (FHC Inc, APM). Le pic a été fermée discriminateur par un signal de déclenchement du processeur d'image vidéo, de sorte que les temps de pic ont été enfermés au stimulus.

Discussion

Enregistrements de fibre optique sont une approche intéressante pour aborder les questions d'expérimentation sur l'encodage et la transmission des informations rétiniennes qui nécessitent un oeil intact. Par ailleurs, les propriétés de signalisation des deux yeux peuvent être étudiés dans pratiquement le même état physiologique si l'électrode est placée dans le chiasma ou des voies où l'activité des croisés et décroisés fibres du nerf optique peuvent être enregistrés avec un taux de pénétration seule électrode. Enregistrements de fibre optique sont communes chez le chat, mais pas dans d'autres modèles animaux populaires utilisés dans la recherche de vision, comme les rongeurs, peut-être en raison de leur petite taille. Nous avons essayé une variété d'électrodes commerciales de l'impédance similaires et matérielles, dont aucun n'a été réussi à ramasser l'activité de fibre unique chez le rat, et encore moins de l'enregistrement de plusieurs heures comme nos électrodes peuvent. Cela implique que la géométrie particulière de nos électrodes, qui ont une longue pointe effilée, par opposition à la pointe émoussée de gamme typique des commerciaux, est importante pour l'isolement fiable et stable de cellules ganglionnaires trains pic axone. En plus de montrer comment fabriquer ces électrodes, nous illustrons notre système conçu sur mesure pour la stéréotaxie in vivo de recherche neurophysiologique visuelle. Le système est construit pour protéger la microélectrode à haute impédance de la vibration de l'environnement et du bruit électromagnétique. Cela est essentiel pour l'enregistrement des potentiels d'action produit par de petits axones (par rapport aux corps cellulaires) pour une période prolongée de temps, surtout avec un écran d'ordinateur placé à proximité. Elle le fait avec une stabilité exceptionnelle et un rapport signal sur bruit, avec des temps d'enregistrement typique d'une heure ou plus et le niveau sonore de l'ordre de dizaines de microvolts. Ces caractéristiques font de la configuration particulièrement utile pour les chercheurs en vision visant à enregistrer in vivo à partir de fibres nerveuses de la rétine ou d'autres régions cérébrales.