セルフメイドサイトスピン装置を用いてヒト多能性幹細胞の免疫細胞化学的解析

Summary

細胞表面マーカー（SSEA-3/SSEA-4）のためのヒト多能性幹細胞（hPSCs）の懸濁液を免疫細胞化学染色を観察し、定量化のための細胞の単層を作成するために自作サイトスピン装置の使用に基づいて達成された。

Abstract

ヒト胚性幹細胞（ヒトES）とヒトの人工多能性幹細胞（hiPSCs）を含むヒト多能性幹細胞（hPSCsは）彼らの無限の自己複製機能と、複数の細胞型に分化する潜在能力に起因する刺激的な細胞源です。 hPSCsの多能性状態は、典型的には、定量PCR、免疫細胞化学などの手法によって評価され、その他で

Protocol

パート1：サスペンション免疫細胞化学染色

1. 細胞は、単一の細胞懸濁液に収穫される。
2. 次に、細胞を1.5 - 2mLのマイクロチューブに移し、4分間200グラムで遠心分離されています。
3. （のMg ²なし⁺及びCa ^{2 +）}とし、4分間、200グラムで、再び遠心分離-細胞は、PBS 1mLのに再懸濁し、上清を吸引することによって洗浄される。これを2回行う必要があります。
4. 洗浄後、細胞を10分間室温で4％パラホルムアルデヒド（PFA）の1mLのにそれらを再懸濁させることによって固定されています。
5. 細胞をPBS液1mLを再度2回洗浄されている - 。
6. 洗浄後、ブロック液の1mLの（6％serum/94％PBS - ）でそれらを再懸濁することによりブロックの細胞。 45分間室温でこれらをインキュベートする。
7. 後、4分間200グラムでチューブを遠心し、ブロックのソリューションを吸引除去する。一次抗体溶液（推奨希釈率でブロックソリューションで作られた）の1mlの細胞を再懸濁する。細胞は、どちらか1時間または4℃で一晩、次の手順に進む前に、室温でインキュベートすることができます。
8. 次に、細胞をブロックソリューション液1mLで2回洗浄する。
9. 後、二次抗体溶液の1mlの再サスペンド細胞（推奨希釈度でブロックソリューションで作られた）と1時間室温でインキュベートする。
10. 1時間後、細胞はその後、ブロックのソリューション液1mLを再度2回洗浄する必要があります。
11. ブロックソリューションで洗浄後、PBS液1mLで再び細胞を洗浄 - 。
12. 様々な洗浄後、1mLの中で細胞を再懸DAPI核染色（PBS中のDAPIの1:10,000希釈 - ）と室温で5分間インキュベートする。
13. 5分後、4分間200グラムでチューブを遠心する。 - PBS液1mLにDAPI核染色液と再サスペンド細胞を吸引除去する。

パート2：サイトスピン装置によって生成されたスライドのhPSCsの取り込み

1. プラスチック製のスライドは、ドリルを押すだけで、それらの穴の望ましい量を加えることによって調製される。直径は、ほとんどの1ミリメートルで使用するマイクロピペット先端（s）の広い直径よりも大きくする必要があります。
2. ろ紙は、ハサミでプラスチック製のスライドのパラメータにカットされます。
3. セキュリティホールは、濾紙で作られています。穴の大きさ（s）はマイクロピペットの先端（s）はそれを介してぴったり収まるように十分な大きさでなければなりません。
4. 後は、準備プラスチックのスライドの一つは、上部とカットフィルター紙の下部（図1）に配置されたのスライドガラス上に配置されます。層は、テープで固定されています。
5. パート1から汚された細胞懸濁液の100μLの最大は、（希望する単層の密度に応じて）その後、マイクロピペット先端（s）の上部に配置されます。
6. 必要に応じて、細胞溶液を持つ装置を秤量し、同じような重量のカウンターバランスを作成することができます。
7. サイトスピン装置とカウンターバランスは、デスクトップ遠心分離機に入れ、4分間、200グラムで遠心分離されることができる。
8. 遠心分離後、サイトスピン装置を慎重にスライドガラスから細胞を取り除きますdoesntのように逆アセンブルされます。
9. 必要に応じて、過剰な周囲のPBS - ガラス側には出吸引。
10. 次いで、細胞を、目的の細胞単層が達成されたかどうかを確認するために蛍光顕微鏡を使用して表示することができます。

パート3：取付スライド

1. 希望されている実装メディアの低下は細胞を含む各地域の中心部に配置されます。
2. 後、カバースリップを静かに、可能であれば、気泡を回避しようとスライド上に低下する。
3. 過剰マウントメディアは、スライドから削除されます。
4. 後は、カバーガラスの側面は、マニキュアで密封されています。
5. 結果が観察され、文書化されるまでスライドは暗い記憶領域に保つことができます。

Discussion

私たちの研究室の目的のためには、マウス胚性繊維芽細胞（MEF）上に成長させた幹細胞培養の35mmディッシュは、サイトスピン装置で使用するための免疫細胞化学染色の手続きのために割り当てられます。その後、細胞を単一細胞懸濁液に、可能な限りMEF層のを除去する、継代酵素によって収集されます。 MEFの層から、より効果的な幹細胞の分離が必要な場合は、コロニーを手動で懸濁液に消化してピックアップすることができます。フィーダーフリーの条件が、幹細胞培養の成長に使用されている場合、コロニーは単に掻きと懸濁液に消化することができます。最初の単一細胞懸濁液が理想的ですが、任意の細胞塊は、効果的に免疫細胞化学的染色法で求め、多くの洗浄と再懸濁のステップを通して離れて分割する必要があります。

ビデオでは、染色hPSCsのための細胞外マーカーの使用に焦点を当てた。 hPSCsの細胞内染色が所望される場合、ブロックSolutionの添加（ステップ1.6）の前に追加のステップは、細胞を透過処理溶液の1mLの（ツイーン20の25μlの持つ高塩分バッファーの50mLs）で3回洗浄される、請求を実行する必要がある前に再懸ブロックソリューションでそれらを。言及すべき別の重要なポイントは、手順のステップ1.9から、注意が蛍光二次抗体の漂白とDAPI核の染色を防ぐために、サンプルへの露光を最小限に取られるべきであるということです。

ために多数の洗浄と手順における再懸濁の手順、400K - 600K細胞の周りにいると推定される流路に対応した幹細胞のコロニー、かなりの量と全体の35mmディッシュ、初期の懸濁液中で消化されることをお勧めして使用されます。 。これは、手続きの性質に起因するいくつかの細胞の損失を見込んで行われます。理論的には、細胞の非常に小さい量は、初期の懸濁液中で使用できますが、ケアの余分な量は、さらに細胞の損失を最小限に抑えるために注意する必要があります。免疫細胞化学染色の手順の後にサイトスピン装置にロードする場合は、10K - 50Kの細胞密度は理想的です。理想的な細胞密度を含む推奨されている - それは100μLが0.1μL10μLピペットチップを使用してcytopsin装置にロードすることができる最大量、より少量（30μlの20μL程度）である間、という点を考慮する必要があります。これは、スライドグラス上に液体の不要なオーバーフローを最小限に抑えます。最後に、装置は横移動から安全である限り、遠心機でサイトスピン装置を使用する場合は、実行中に遠心によって作成される力は、我々の知識に、反転または落下装置を維持するに十分なされています。

免疫細胞化学的手順で使用するソリューションのための成分：

1. 2％パラホルムアルデヒド（PFA）/ 2％スクロース
   1. 75ミリリットルの蒸留水を追加し、56℃加熱撹拌プレート上での場所℃に
   2. 2グラムPFAを秤量し、ガラスビーカーに加える。
   3. 2 gのショ糖を秤量し、ガラスビーカーにPFAに追加します。
   4. 1M水酸化ナトリウムを2滴を追加します。
   5. すべての試薬が溶液に入ったしたら、10 × PBSの10mlを追加+ +。
   6. 7.2から7.4への溶液のpHを調整します。
   7. 蒸留水で100mlにボリュームを起動します。
      4℃、および1週間以内に使用してください。アリコートを、1ヶ月間@ -20℃保存することができます。沈殿物を除去するために解凍した後、スピンダウンする。
2. ブロックソリューション（10ml）を
   1. 9.4ミリリットルPBSを追加 - 。
   2. PBS 0.6 mlの血清を追加 - 。 （これは、各抗体のために最適化する必要があるかもしれません。）
      4℃、および48時間以内に使用してください。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab Tek Permanox Chamber Slide	Thermo Fisher Scientific, Inc.	117437	Material for re-used plastic slides
Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned	Fisher Scientific	12-550-15
0.1-10μL Filter Tips	USA Scientific, Inc.	1121-3810
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	120542-B
Cytoseal 280	Richard-Allan Scientific	8311-4	Mounting Medium
DPBS	GIBCO, by Life Technologies	14190
Normal Goat Serum	Invitrogen	10000C
Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody	EMD Millipore	MAB4304	Primary Antibody for SSEA-4 staining
Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody	EMD Millipore	MAB4303	Primary Antibody for SSEA-3 staining
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG	Invitrogen	A11029	Secondary Antibody for SSEA-4 staining
Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG	Invitrogen	A11006	Secondary Antibody for SSEA-3 staining
DAPI, Dihydrochloride	Calbiochem	268298