Immuncytokemiska Analys av mänskliga pluripotenta stamceller med hjälp av en self-made Cytospin Apparater

Summary

Avstängning immuncytokemiska färgning av mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs) för cellytan markörer (SSEA-3/SSEA-4) uppnåddes baseras på användning av en self-made cytospin apparater för att skapa ett monolager av celler för observation och kvantifiering.

Abstract

Mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs) som omfattar mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) är spännande cell källor på grund av deras gränslösa självförnyelse förmåga och sina möjligheter att differentieras till olika celltyper. Den pluripotenta tillstånd hPSCs är normalt bedöms av tekniker såsom qPCR, immuncytokemi, och av andra

Protocol

Del 1: Suspension immuncytokemiska färgning

1. Celler skördas i en enda cell suspension.
2. Cellerna överförs sedan till 1,5-2ml mikrocentrifugrör och centrifugeras vid 200g i 4 minuter.
3. Cellerna tvättas genom att aspirera ut supernatanten resuspenderas i 1 mL PBS - (utan Mg ^{2 +} och Ca ^{2 +)} och därefter centrifugeras igen vid 200g i 4 minuter. Detta bör göras två gånger.
4. Efter tvätt, celler sedan fastställas av re-avbryta dem i 1 mL 4% paraformaldehyd (PFA) i rumstemperatur i 10 minuter.
5. Cellerna tvättas igen två gånger med 1 mL PBS -.
6. Efter tvätt, blockera celler genom att åter avbryta dem i 1 mL Block Solution (6% serum/94% PBS -). Inkubera dessa i rumstemperatur i 45 minuter.
7. Efter, centrifugrör på 200g i 4 minuter och aspirera på Block Solution. Återsuspendera celler i 1 mL den primära antikroppen lösningen (görs med Block-lösning rekommenderas utspädning). Celler kan antingen inkuberas i rumstemperatur i 1 timme eller vid 4 ° C över natten innan du fortsätter till nästa steg.
8. Celler är sedan tvättas två gånger med 1 mL Block Solution.
9. Efter, återsuspendera celler i 1 mL sekundär antikropp-lösning (gjord med Block-lösning rekommenderas utspädning) och inkubera i rumstemperatur i 1 timme.
10. Efter 1 timme, bör cellerna sedan tvättas igen två gånger med 1 mL Block Solution.
11. Efter tvättning med Block och tvätta cellerna igen med 1 mL PBS -.
12. Efter de olika tvättar, återsuspendera celler i 1 mL DAPI nukleära bets (1:10,000 utspädning av DAPI i PBS -) och inkubera vid rumstemperatur i 5 minuter.
13. Efter 5 minuter, centrifugrör på 200g i 4 minuter. Sug ut DAPI kärnkraft fläcken lösning och återsuspendera cellerna i 1 mL PBS -.

Del 2: Integrering av hPSCs i bilderna skapas genom cytospin apparater

1. Plast diabilder förbereds genom att önskad mängd hål i dem med en borr press. Diametern måste vara högst 1 mm större än den största diametern på mikropipett spetsen (er) som skall användas.
2. Filterpapper skärs av parametrarna i plasten bilden med en sax.
3. Hål görs sedan i filtrerpapper. Storleken på hålet (s) bör vara tillräckligt stor för att mikropipett spetsen (er) passar snuggly genom den.
4. Efter en av de förberedda plast bilderna är placerad på toppen och en glasplatta i monterade längst ner snittet filterpapper (Figur 1). Lagren är säkrade med tejp.
5. Maximalt 100μL (beroende på önskad monolager densitet) av de färgade cellsuspensionen från del 1 är sedan placeras i toppen av mikropipett spetsen (s).
6. Vid behov kan apparaten med cellen lösning vägas och en motvikt samma vikt skapas.
7. Den cytospin apparater och motvikt kan placeras sedan i en stationär centrifug och centrifugeras vid 200g i 4 minuter.
8. Efter centrifugering är cytospin apparaten försiktigt isär på ett sätt som doesnt lösgöra cellerna från glaset bilden.
9. Om det behövs mer än omgivande PBS - på glas sida i aspireras ut.
10. Celler kan sedan visas med en fluorescensmikroskop för att kontrollera om den önskade cellen cellslager har uppnåtts.

Del 3: Montering diabilder

1. En droppe av den önskade monteringsmedel placeras direkt i mitten av varje område som innehåller celler.
2. När är en cover glida försiktigt sänks ned på bilderna försöker undvika luftbubblor om möjligt.
3. Överskott montering medier tas sedan bort från diabilder.
4. När är de sidor av täckglas tätas med nagellack.
5. Bilderna kan hållas i ett mörkt förråd tills resultat observeras och dokumenteras.

Discussion

Vid tillämpning av vårt laboratorium, är en 35mm maträtt av kulturer stamceller som odlas på möss embryonala fibroblaster (MEFs) tilldelas för immuncytokemiska färgningsproceduren för användning med cytospin apparaten. Cellerna är sedan samlas in genom enzymatisk passaging, ta bort så mycket av MEF lager som möjligt i en enda cellsuspension. Om effektivare stamceller isoleras från MEF lagret önskas kan bisamhällena manuellt plockas sedan rötas till suspension. Om mataren fria villkor används i växande stamcellerna kulturer, kan kolonierna helt enkelt skrapas bort och rötas till suspension. Medan en första encelliga fjädring är perfekt, bör alla cellulära klumpar effektivt brytas isär hela talrika tvätt och resuspension steg efterlystes i immuncytokemiska färgningsproceduren.

Videon fokuserade på användning av extracellulära markörer för färgning hPSCs. Om intracellulär färgning av hPSCs önskas, behöver ytterligare ett steg innan tillsättning av Block Solution (steg 1,6) göras där cellerna tvättas i 1 mL Permeabilization Solution (50mLs av hög salt Buffert med 25μL av Tween 20) tre gånger innan du avbryta dem i Block Solution. En annan kritisk punkt som bör nämnas är att i steg 1,9 i förfarandet, bör man för att minimera ljusexponering till proverna för att förhindra fluorescens blekning av sekundär antikropp och DAPI kärnkraft fläcken.

På grund av de många tvätt och resuspension steg i proceduren, en hel 35mm rätt med en bra mängd passage-klar kolonier stamceller, beräknas ha runt 400k-600k celler, rekommenderas att smälta och används i första fjädring . Detta görs i väntan på att någon cell förlust på grund av karaktären av förfarandet. Teoretiskt kan en mycket mindre mängd celler kan användas i den inledande avstängning, men extra mycket försiktighet måste vidtas för att ytterligare minimera cell förlust. När du laddar upp på cytospin apparaten efter immuncytokemiska färgningsproceduren är en cell täthet av 10k-50k ideal. Det bör nämnas att även 100μL är det maximala belopp som kan lastas på en cytopsin apparat som använder ett 0.1μL 10μL mikropipett spets, en mindre andel (cirka 20μL - 30μL) som innehåller den ideala celltätheten rekommenderas. Detta minimerar onödigt överflöd av vätska på glaset bilden. Slutligen, när du använder cytospin apparaten med centrifug, så länge apparaten är säker från sidoförskjutning, den kraft som skapas av centrifugen medan du kör har, såvitt vi vet, varit tillräcklig i att hålla apparaten från flippa eller falla av.

Ingredienser för lösningar som används i immuncytokemiska förfarandet:

1. 2% Paraformaldehyd (PFA) / 2% sackaros
   1. Tillsätt 75 ml destillerat vatten, och lägg på uppvärmda rör om plattan vid 56 ° C.
   2. Väg upp 2 g PFA och lägga till glas bägare.
   3. Väg upp 2 g sackaros, och lägga till PFA i glas bägare.
   4. Tillsätt 2 droppar 1 M natriumhydroxid.
   5. När alla reagenser har gått i lösning, tillsätt 10 ml 10X PBS + +.
   6. Justera lösningens pH till 7,2-7,4.
   7. Ta upp volymen till 100 ml med destillerat vatten.
      Förvaras vid 4 ° C och användas inom en vecka. Alikvoter kan lagras @ -20 ° C i 1 månad. Centrifugera kort efter upptining för att ta bort eventuell fällning.
2. Blockera lösning (10mL)
   1. Tillsätt 9,4 ml PBS -.
   2. Tillsätt 0,6 ml serum till PBS -. (Detta kan behöva optimeras för varje antikropp.)
      Förvaras vid 4 ° C och användas inom 48 timmar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab Tek Permanox Chamber Slide	Thermo Fisher Scientific, Inc.	117437	Material for re-used plastic slides
Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned	Fisher Scientific	12-550-15
0.1-10μL Filter Tips	USA Scientific, Inc.	1121-3810
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	120542-B
Cytoseal 280	Richard-Allan Scientific	8311-4	Mounting Medium
DPBS	GIBCO, by Life Technologies	14190
Normal Goat Serum	Invitrogen	10000C
Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody	EMD Millipore	MAB4304	Primary Antibody for SSEA-4 staining
Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody	EMD Millipore	MAB4303	Primary Antibody for SSEA-3 staining
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG	Invitrogen	A11029	Secondary Antibody for SSEA-4 staining
Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG	Invitrogen	A11006	Secondary Antibody for SSEA-3 staining
DAPI, Dihydrochloride	Calbiochem	268298