Análise imunocitoquímica de células-tronco humanas pluripotentes usando um Self-Made Aparelho Cytospin

Summary

Suspensão coloração imunocitoquímica de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) para marcadores da superfície celular (SSEA-3/SSEA-4) foi alcançada com base na utilização de um aparelho cytospin self-made para criar uma monocamada de células para observação e quantificação.

Abstract

Células pluripotentes estaminais humanas (hPSCs) que incluem células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSCs) são fontes de células emocionante devido à sua ilimitada capacidade de auto-renovação e seu potencial de se diferenciar em vários tipos de células. O estado de pluripotentes hPSCs é tipicamente avaliada por técnicas tais como qPCR, imunocitoquímica, e por outros

Protocol

Parte 1: Coloração Suspensão imunocitoquímico

1. As células são colhidas em uma suspensão de células individuais.
2. As células são então transferidos para um tubo de microcentrífuga de 1,5 2mL e centrifugado a 200g por 4 minutos.
3. As células são lavadas por aspiração fora sobrenadante, re-suspensas em 1mL de PBS - (sem Mg ^{2 +} e Ca ^{2 +)} e depois centrifugada novamente a 200g por 4 minutos. Isto deve ser feito duas vezes.
4. Após a lavagem, as células são então fixado pelo re-suspendendo-as em 1mL de 4% paraformaldeído (PFA) em temperatura ambiente por 10 minutos.
5. As células são lavadas novamente duas vezes com 1mL de PBS -.
6. Depois de células de lavar roupa, bloco por re-suspendendo-as em 1 ml de solução de bloco (6% serum/94% PBS -). Incubar esses em temperatura ambiente por 45 minutos.
7. Após, centrifugar tubos de 200g por 4 minutos e aspirar a Solução Block. Re-suspender as células em 1mL da solução de anticorpo primário (feito com solução de Bloco na diluição recomendada). As células podem ser incubadas em temperatura ambiente por 1 hora ou a 4 ° C durante a noite antes de prosseguir para a próxima etapa.
8. Células são então lavadas duas vezes com 1 ml de solução Block.
9. Depois, volte a suspender as células em 1mL de solução de anticorpo secundário (feito com solução de Bloco na diluição recomendada) e incubar à temperatura ambiente por 1 hora.
10. Depois de uma hora, as células devem ser lavadas novamente duas vezes com 1 ml de solução Block.
11. Após a lavagem com solução de Bloco, lave as células novamente com 1mL de PBS -.
12. Após as lavagens diversas, re-suspender as células em 1mL de DAPI nuclear mancha (diluição de 1:10.000 em PBS DAPI -) e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos.
13. Após 5 minutos, centrifugar tubos de 200g por 4 minutos. Aspirar a solução nuclear DAPI mancha e re-suspender as células em 1mL de PBS -.

Parte 2: Incorporação de hPSCs em slides gerados por aparelhos cytospin

1. Slides de plástico são preparados por fazer a quantidade desejada de furos com uma broca imprensa. O diâmetro deve ser no máximo um milímetro maior que o maior diâmetro da ponta da micropipeta (s) a ser utilizado.
2. Filtro de papel é cortado com os parâmetros da lâmina de plástico com uma tesoura.
3. Furos são feitos então no papel de filtro. O tamanho do buraco (s) deve ser grande o suficiente para que a ponta micropipeta (s) se encaixa confortavelmente através dele.
4. Depois, um dos slides de plástico preparado é colocado na parte superior e uma lâmina de vidro na colocados na parte inferior do papel filtro de corte (Figura 1). As camadas são fixados com fita adesiva.
5. Um máximo de 100μL (dependendo da densidade desejada monocamada) da suspensão de células coradas da Parte 1 é então colocado no topo da ponta da micropipeta (s).
6. Se necessário, o aparelho com a solução de célula pode ser pesado e um contrapeso de peso semelhante criado.
7. O aparelho cytospin e contrapeso pode são então colocados em uma centrífuga de mesa e centrifugado a 200g por 4 minutos.
8. Após a centrifugação, o aparelho é cuidadosamente desmontado cytospin de uma forma que doesnt desalojar as células da lâmina de vidro.
9. Se necessário, o excesso de PBS redor - do lado de vidro em aspirados para fora.
10. As células podem ser visualizados usando um microscópio de fluorescência para verificar se a monocamada de células desejado foi alcançado.

Parte 3: slides de montagem

1. A queda dos meios de comunicação de montagem desejada é colocado diretamente no centro de cada área contendo células.
2. Depois, a lamínula é suavemente baixou para os slides tentando evitar as bolhas de ar, se possível.
3. Excesso de meios de montagem é então removido do slides.
4. Depois, os lados do lamínulas são selados com verniz.
5. Os slides podem ser mantidos em uma área de armazenamento escuro até que os resultados são observados e documentados.

Discussion

Para efeitos do nosso laboratório, um prato de 35 milímetros de culturas de células-tronco cultivadas em fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) é alocado para o procedimento de coloração imunocitoquímica para uso com o aparelho cytospin. As células são então coletados por meio de passaging enzimática, removendo o máximo da camada de MEF quanto possível, em uma suspensão de uma única célula. Se mais de isolamento de células-tronco eficaz a partir da camada MEF é desejada, as colônias podem ser manualmente escolheu então digerida em suspensão. Se as condições de alimentação livres são usados ​​no cultivo de células-tronco as culturas, as colônias podem simplesmente ser raspada e digerida em suspensão. Enquanto uma suspensão de uma única célula inicial é ideal, qualquer aglomerados celulares deve efetivamente ser quebrados por toda a lavagem de numerosos e re-suspensão passos no chamado o procedimento de coloração imuno-histoquímico.

O vídeo focado no uso de marcadores extracelulares para hPSCs coloração. Se a coloração intracelular do hPSCs é desejado, um passo adicional antes da adição da solução de Bloco (Passo 1.6) precisa ser feito no qual as células são lavadas com 1 ml de solução permeabilização (50mLs de tampão Sal alta com 25μL de Tween 20), três vezes antes de voltar a suspendê-las em solução de Bloco. Outro ponto crítico que deve ser mencionado é que a partir da Etapa 1,9 no procedimento, deve ser tomado cuidado para minimizar a exposição à luz para as amostras para prevenir o branqueamento de fluorescência do anticorpo secundário e DAPI nuclear mancha.

Por causa da lavagem de numerosos e re-suspensão etapas do procedimento, um prato inteiro de 35mm com uma boa quantidade de passagem pronto para colônias de células-tronco, estima-se que em torno de 400k 600k-células, é recomendado para ser digerido e usado na suspensão inicial . Isto é feito em antecipação de alguma perda de células devido à natureza do procedimento. Teoricamente, uma quantidade muito menor de células pode ser utilizado na suspensão inicial, mas uma quantidade extra de cuidados devem ser tomados a fim de minimizar ainda mais a perda de células. Quando o colocar no aparelho cytospin após o procedimento de coloração imunocitoquímica, a densidade das células de 10k-50k é o ideal. Deve-se mencionar que, embora 100μL é a quantidade máxima que pode ser carregado em um aparelho que usa uma cytopsin 0.1μL 10μL ponta micropipeta, uma quantidade menor (cerca de 20μL - 30μL) contendo a densidade de células ideal é recomendado. Isso minimiza estouro desnecessária de líquido sobre a lâmina de vidro. Finalmente, ao usar o aparelho cytospin com a centrífuga, desde que o aparelho é seguro do movimento lateral, a força criada pela centrífuga durante a execução tem, a nosso conhecimento, foi suficiente para manter o aparelho a partir lançando ou cair.

Ingredientes para soluções utilizadas no procedimento de imunocitoquímica:

1. Paraformaldeído 2% (PFA) / 2% de sacarose
   1. Adicionar 75 ml de água destilada e coloque no prato de agitar aquecida a 56 ° C.
   2. Pesar 2 g PFA, e adicione ao copo de vidro.
   3. Pesar 2 g de sacarose, e adicione a PFA em copo de vidro.
   4. Adicione 2 gotas de hidróxido de sódio 1M.
   5. Uma vez que todos os reagentes ter ido para solução, adicione 10 ml de PBS 10X + +.
   6. Ajustar o pH da solução para 7,2-7,4.
   7. Trazer um volume de 100 ml com água destilada.
      Armazenar a 4 ° C, e usar dentro de 1 semana. Alíquotas podem ser armazenados @ -20 ° C por 1 mês. Centrifugar brevemente após o descongelamento para remover qualquer precipitado.
2. Solução de bloco (10 ml)
   1. Adicionar 9,4 ml de PBS -.
   2. Adicionar 0,6 ml de soro para a PBS -. (Isto pode precisar de ser otimizado para cada anticorpo.)
      Armazenar a 4 ° C, e usar dentro de 48 horas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab Tek Permanox Chamber Slide	Thermo Fisher Scientific, Inc.	117437	Material for re-used plastic slides
Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned	Fisher Scientific	12-550-15
0.1-10μL Filter Tips	USA Scientific, Inc.	1121-3810
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	120542-B
Cytoseal 280	Richard-Allan Scientific	8311-4	Mounting Medium
DPBS	GIBCO, by Life Technologies	14190
Normal Goat Serum	Invitrogen	10000C
Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody	EMD Millipore	MAB4304	Primary Antibody for SSEA-4 staining
Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody	EMD Millipore	MAB4303	Primary Antibody for SSEA-3 staining
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG	Invitrogen	A11029	Secondary Antibody for SSEA-4 staining
Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG	Invitrogen	A11006	Secondary Antibody for SSEA-3 staining
DAPI, Dihydrochloride	Calbiochem	268298