Análisis inmunocitoquímico de las células madre pluripotentes utilizando un aparato de Self-Made Cytospin

Summary

Tinción inmunohistoquímica suspensión de las células madre pluripotentes (hPSCs) para los marcadores de la superficie celular (SSEA-3/SSEA-4) se logró basada en el uso de un aparato hecho a sí mismo citospina para crear una monocapa de células para la observación y cuantificación.

Abstract

Las células madre pluripotentes (hPSCs) que incluyen células madre embrionarias humanas (hESCs) y las células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs) son una fuente interesante de células debido a su ilimitada capacidad de auto-renovación y su potencial de diferenciarse en múltiples tipos de células. El estado pluripotente de hPSCs se suele evaluar mediante técnicas como la PCR cuantitativa, inmunocitoquímica, y por otros

Protocol

Parte 1: La tinción inmunocitoquímica de suspensión

1. Las células se recogen en una suspensión de células individuales.
2. Las células se transfieren a tubos de microcentrífuga de 1,5 2 ml y se centrifuga a 200 g durante 4 minutos.
3. Se lavan las células mediante la aspiración de sobrenadante, se resuspendieron en 1 ml de PBS - (sin Mg ^{2 +} y Ca ^{2 +)} y luego se centrifuga de nuevo a 200 g durante 4 minutos. Esto debe hacerse dos veces.
4. Después del lavado, las células se fijan por la re-suspensión en paraformaldehído% 1 ml de 4 (PFA) a temperatura ambiente durante 10 minutos.
5. Las células se lavan de nuevo dos veces con 1 ml de PBS -.
6. Después de lavar las células bloque, por volver a suspender en 1 ml de solución de bloque (6% serum/94% PBS -). Incubar estos a temperatura ambiente durante 45 minutos.
7. Después, centrifugar los tubos a 200 g durante 4 minutos y aspirar a la solución de bloque. Vuelva a suspender las células en 1 ml de la solución de anticuerpo primario (hecho con la solución de bloque a la dilución recomendada). Las células pueden ser incubados a temperatura ambiente durante 1 hora o menos 4 ° C durante la noche antes de proceder al siguiente paso.
8. Las células se lavan dos veces con 1 ml de solución de bloque.
9. Después, volver a suspender las células en 1 ml de solución de anticuerpo secundario (hecho con la solución de bloque a la dilución recomendada) e incubar a temperatura ambiente durante 1 hora.
10. Después de 1 hora, las células se deben lavar de nuevo dos veces con 1 ml de solución de bloque.
11. Después de lavar con solución de bloque, lavar las células de nuevo con 1 ml de PBS -.
12. Después de los lavados diferentes, volver a suspender las células en 1 ml de DAPI tinción nuclear (1:10.000 dilución de DAPI en PBS -) e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
13. Después de 5 minutos, centrifugar los tubos a 200 g durante 4 minutos. Aspirar la solución de DAPI nuclear mancha y volver a suspender las células en 1 ml de PBS -.

Parte 2: Incorporación de hPSCs en las diapositivas generadas por el aparato citospina

1. Toboganes de plástico son preparados por lo que la cantidad deseada de agujeros con un taladro. El diámetro debe ser como máximo de 1 mm más grande que el diámetro más ancho de la punta de la micropipeta (s) que se utilizará.
2. Papel de filtro se corta a los parámetros de la corredera de plástico con unas tijeras.
3. Entonces se hacen agujeros en el papel de filtro. El tamaño del agujero (s) debe ser lo suficientemente grande que la punta de la micropipeta (s) queda a su medida a través de él.
4. Después, uno de los toboganes de plástico preparado se coloca en la parte superior y una lámina de vidrio en colocar en la parte inferior del papel de filtro de corte (Figura 1). Las capas están asegurados con cinta adhesiva.
5. Un máximo de 100μL (dependiendo de la densidad deseada monocapa) de la suspensión de células manchadas de la parte 1 se coloca en la parte superior de la punta de la micropipeta (s).
6. Si es necesario, el aparato con una solución de células pueden ser pesados ​​y crearon un contrapeso de un peso similar.
7. El aparato citospina y contrarrestar pueden se colocan en una centrífuga de sobremesa y se centrifuga a 200 g durante 4 minutos.
8. Después de la centrifugación, el aparato ha sido cuidadosamente citospina desmontado de una manera que doesnt caer las células de la lámina de vidrio.
9. Si es necesario, el exceso de PBS alrededores - en el lado de vidrio en aspirado a cabo.
10. Las células se pueden ver utilizando un microscopio de fluorescencia para comprobar si la monocapa celular deseado ha sido alcanzado.

Parte 3: Montaje de diapositivas

1. Una caída de los medios de montaje deseada se coloca directamente en el centro de cada área que contiene las células.
2. Después, una hoja de cubierta es suave baja en las diapositivas tratando de evitar burbujas de aire si es posible.
3. El exceso de medios de montaje se elimina a partir de diapositivas.
4. Después, los laterales de la cubierta se desliza se sellan con esmalte de uñas.
5. Las diapositivas se pueden mantener en un área de almacenamiento en la oscuridad hasta que los resultados son observados y documentados.

Discussion

A los efectos de nuestro laboratorio, un plato de 35 mm de cultivos de células madre cultivadas en fibroblastos de ratón embrionario (MEFs) es asignado para el procedimiento de tinción inmunohistoquímica para su uso con el aparato cytospin. Las células se recogen por medio de pases enzimática, eliminar la mayor cantidad de la capa de MEF como sea posible, en una suspensión de una sola célula. Si más eficaz de aislamiento de células madre de la capa de MEF se desea, las colonias pueden ser recogidos manualmente después se digiere en suspensión. Si las condiciones de alimentación libre se utilizan en el cultivo de las células madre culturas, las colonias sólo puede ser levantada y se digiere en suspensión. Mientras que una única célula inicial de la suspensión es ideal, los grupos celulares efectivamente debe ser descompuesto en todo el lavado de numerosos pasos y re-suspensión se pide en el procedimiento de tinción inmunohistoquímica.

El vídeo se centró en el uso de marcadores extracelular para hPSCs manchas. Si la tinción intracelular de la hPSCs se desea, un paso adicional antes de la adición de la solución de bloque (Paso 1.6) que hay que hacer en el que se lavan las células en 1 ml de solución de permeabilización (50mLs de sal de amortiguación de alta con 25μL de Tween 20) tres veces antes de volver a suspender en solución de bloqueo. Otro punto crítico que debe ser mencionado es que a partir del paso de 1,9 en el procedimiento, se debe tener cuidado en la reducción de exposición a la luz de las muestras para prevenir la decoloración de la fluorescencia de la secundaria de anticuerpos y la mancha DAPI nuclear.

Debido a las numerosas lavado y resuspensión pasos del procedimiento, un plato entero de 35 mm con una buena cantidad de pasaje listo para las colonias de células madre, estima que hay unos 400k-600k células, se recomienda para ser digerida y utilizada en la suspensión inicial . Esto se hace en previsión de una pérdida de células debido a la naturaleza del procedimiento. En teoría, una cantidad mucho menor de células pueden ser utilizados en la suspensión inicial, pero una cantidad extra de se debe tener cuidado con el fin de minimizar aún más la pérdida de células. Cuando se carga en el aparato citospina después el procedimiento de tinción inmunohistoquímica, una densidad celular de 10k-50k es lo ideal. Cabe mencionar que, aunque 100μL es la cantidad máxima que se puede cargar en un aparato que utiliza una cytopsin 0.1μL 10μL punta de la micropipeta, una cantidad menor (alrededor de 20μL - 30μL) con la densidad celular ideal es recomendado. Esto reduce al mínimo necesario desbordamiento de líquidos sobre el portaobjetos de vidrio. Finalmente, cuando se utiliza el aparato citospina con la centrífuga, siempre y cuando el aparato está a salvo de movimiento lateral, la fuerza creada por la centrífuga durante la ejecución tiene, a nuestro entender, de acuerdo sido suficiente el aparato de mover de un tirón o se caiga.

Ingredientes para las soluciones utilizadas en el procedimiento de inmuno:

1. 2% de paraformaldehído (PFA) / 2% de sacarosa
   1. Añadir 75 ml de agua destilada, y el lugar en placa de agitación se calienta a 56 ° C.
   2. Pesar 2 g de PFA, y añadir al vaso de vidrio.
   3. Pesar 2 g de sacarosa y añadir a la PFA en el vaso de vidrio.
   4. Agregar 2 gotas de hidróxido de sodio 1M.
   5. Una vez que todos los reactivos se han ido a la solución, agregar 10 ml de PBS 10X + +.
   6. Ajustar el pH de la solución a 7.2-7.4.
   7. Que aparezca el volumen a 100 ml con agua destilada.
      Almacenar a 4 ° C, y su uso dentro de una semana. Alícuotas se pueden almacenar @ -20 ° C durante 1 mes. Centrifugar brevemente después de la descongelación de quitar cualquier precipitado.
2. Bloque de la solución (10 ml)
   1. Añadir 9,4 ml de PBS -.
   2. Añadir 0,6 ml de suero a la PBS -. (Esto puede necesitar ser optimizado para cada anticuerpo.)
      Almacenar a 4 ° C, y el uso dentro de las 48 horas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab Tek Permanox Chamber Slide	Thermo Fisher Scientific, Inc.	117437	Material for re-used plastic slides
Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned	Fisher Scientific	12-550-15
0.1-10μL Filter Tips	USA Scientific, Inc.	1121-3810
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	120542-B
Cytoseal 280	Richard-Allan Scientific	8311-4	Mounting Medium
DPBS	GIBCO, by Life Technologies	14190
Normal Goat Serum	Invitrogen	10000C
Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody	EMD Millipore	MAB4304	Primary Antibody for SSEA-4 staining
Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody	EMD Millipore	MAB4303	Primary Antibody for SSEA-3 staining
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG	Invitrogen	A11029	Secondary Antibody for SSEA-4 staining
Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG	Invitrogen	A11006	Secondary Antibody for SSEA-3 staining
DAPI, Dihydrochloride	Calbiochem	268298