Summary
Подвеска иммуноцитохимического окрашивания клеток человека плюрипотентных стволовых (hPSCs) на поверхности клеток маркеры (SSEA-3/SSEA-4) был достигнут на основе использования самодельных цитоспина аппарат для создания монослоя клеток для наблюдения и количественной оценки.
Abstract
Человека плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs), которые включают человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) человека и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) являются захватывающими источников ячейки из-за их безграничную самообновлению возможности и свой потенциал к дифференцировке в различные типы клеток. Плюрипотентных состояние hPSCs, как правило, оцениваются методы, такие как КПЦР, иммуноцитохимия, а также другими
Protocol
Часть 1: Подвеска Иммуноцитохимическая Окрашивание
- Клетки собирают в единое клеточной суспензии.
- Затем клетки переносят в 1,5-2 мл труб микроцентрифужных и центрифугировали при 200g в течение 4 минут.
- Клетки омываются аспирационных из супернатанта, ресуспендировали в 1 мл PBS - (без Mg 2 + и Са 2 +), а затем снова центрифугировали при 200g в течение 4 минут. Это должно быть сделано в два раза.
- После мытья клетки затем фиксированной путем повторного приостановления их действия в 1 мл 4% параформальдегида (PFA) при комнатной температуре в течение 10 минут.
- Клетки снова промывают два раза с 1 мл PBS -.
- После промывки блока клетки путем повторного приостановления их действия в 1 мл блока Решение (6% serum/94% PBS -). Инкубируйте эти при комнатной температуре в течение 45 минут.
- После, центрифужные пробирки на 200 г в течение 4 минут и аспирата из Блока решение. Повторное приостановить клеток в 1 мл первичного решение антител (сделанный с Блок решения, при рекомендуемой разведение). Клетки могут быть инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа при температуре 4 ° С в течение ночи, прежде чем переходить к следующему шагу.
- Затем клетки дважды промывали 1 мл блока решение.
- После, вновь приостановить клеток в 1 мл вторичного антитела решение (сделанный с Блок решения, при рекомендуемой разведение) и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 часа.
- Через 1 час, камеры должны быть затем снова промывают два раза с 1 мл блока решение.
- После промывки блока решений, мыть клетки снова с 1 мл PBS -.
- После различных моет, вновь приостановить клеток в 1 мл DAPI ядерной пятна (1:10000 разбавления DAPI в ФБР -) и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут.
- Через 5 минут пробирок на 200 г в течение 4 минут. Аспирацию из DAPI ядерной пятно решение и вновь приостановить клеток в 1 мл PBS -.
Часть 2: Включение hPSCs в слайдах порожденных через аппарат цитоспина
- Пластиковые слайды готовы, сделав необходимое количество отверстий в них с сверлильный станок. Диаметра должна быть не более 1 мм больше, чем широкий диаметр кончика микропипетки (ы), которые будут использоваться.
- Фильтровальная бумага разрезается на параметры пластиковых слайдов с помощью ножниц.
- Отверстия затем сделал в фильтровальную бумагу. Размер отверстия (ы) должны быть достаточно большими, что микропипетки наконечник (ы) подходит ожидающий через него.
- После одного из подготовленных слайдов пластиковых находится на вершине, и стекло в помещенных в нижней части разреза фильтровальной бумаги (рис. 1). Слои обеспеченные с лентой.
- Максимум 100 мкл (в зависимости от желаемого монослоя плотности) окрашенных суспензии клеток из части 1 затем помещается в верхнюю часть кончика микропипетки (ы).
- При необходимости аппарат с сотовыми решение может быть взвешены и противовеса подобной вес создан.
- Аппарат цитоспина и противовеса может затем помещаются в настольных центрифуги и центрифугируют при 200g в течение 4 минут.
- После центрифугирования аппарата цитоспина тщательно разобраны таким образом, что оленья кожа выбить клетки стекло.
- При необходимости, избыток окружающего PBS - на боковые стекла в атмосферный из.
- Клетки могут быть просмотрены с помощью флуоресцентного микроскопа, чтобы проверить, желаемый клеточный монослой был достигнут.
Часть 3: Монтаж слайдов
- Капли желаемого монтажа СМИ находится непосредственно в центре каждой из областей, содержащих клетки.
- После, покровное стекло плавно опускается на слайдах пытается избежать пузырьков воздуха, если возможно.
- Превышение монтажа медиа затем удаляется из слайдов.
- После этого, стороны крышки скользит запечатаны с лаком для ногтей.
- Слайды можно хранить в темном месте хранения, пока результаты наблюдаются и задокументированы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для целей нашей лаборатории, 35-мм блюдо из стволовых клеток культур, выращенных на эмбриональных фибробластов мыши (MEFs) выделено на иммуноцитохимического процедуру окрашивания для использования с аппаратом цитоспина. Затем клетки, собранные при помощи ферментативного пассажей, удаляя как можно больше слоев MEF это возможно, в одно-клеточной суспензии. Если более эффективной изоляции стволовых клеток из слоя MEF желательно, колонии можно вручную выбрал затем переваривается в подвеске. Если устройство подачи условиях свободного используются при выращивании стволовых клеток культур, колоний может быть просто соскрести и перевариваются в подвеске. Хотя первоначальный одноклеточных подвески идеально, любой сотовой скопления должны быть эффективно распадаются по всему многочисленные стирки и ресуспензии шаги, предусмотренные в иммуноцитохимического процедуры окрашивания.
Видео сосредоточены на использовании внеклеточных маркеров для окрашивания hPSCs. Если внутриклеточного окрашивания hPSCs желательно, дополнительный шаг перед добавлением Блок Решение (шаг 1.6) должно быть сделано котором клетки промывают в 1 мл пермеабилизации раствор (50 мл высоких буфера Соль с 25 мкл Твин 20) в три раза до повторного приостановления их действия в блоке решения. Другой важный момент, который следует отметить, что, начиная с шага 1.9 в процедуре, необходимо принять меры для сведения к минимуму воздействия света на образцы, чтобы предотвратить флуоресценции отбеливания вторичных антител и DAPI ядерной пятно.
Из-за многочисленных мытье и повторное приостановление этапы процедуры, всего 35 мм блюдо с хорошим количеством проходов готовы колонии стволовых клеток, по оценкам, около 400k-600k клеток, рекомендуется усваивается и используется в исходной суспензии . Это делается в преддверии некоторые клеточные потери, связанные с характером процедуры. Теоретически, значительно меньшее количество клеток может быть использована в исходной суспензии, а дополнительное количество забота должна быть взята для того, чтобы еще больше минимизировать потерю клеток. При загрузке на аппарате цитоспина после иммуноцитохимического процедуры окрашивания, плотность клеток 10k-50k это идеальный вариант. Следует отметить, что, хотя 100 мкл это максимальная сумма, которую можно загрузить на cytopsin аппарат, который использует 0.1μL 10 мкл микропипетки наконечник, меньшее количество (около 20 мкл - 30μL), содержащий идеальное плотность клеток рекомендуется. Это сводит к минимуму ненужное переполнение жидкости на стекло. Наконец, при использовании цитоспина аппарат с центрифугой, пока аппарат безопасности от бокового движения, сила, создаваемая центрифуга во время работы имеет, насколько нам известно, было достаточно в соответствии аппарат от листать или падать.
Ингредиенты для решения, используемые в иммуноцитохимического процедуры:
- 2% Параформальдегид (PFA) / 2% сахарозы
- Добавить 75 мл дистиллированной воды, и место на нагретой пластине перемешивали при 56 ° C.
- Отвесить 2 г PFA, и добавить к стеклянный стакан.
- Отвесить 2 г сахарозы, и добавить к PFA в стеклянный стакан.
- Добавьте 2 капли 1М раствором гидроксида натрия.
- После того как все реагенты прошли в раствор, добавьте 10 мл PBS 10X + +.
- Отрегулируйте рН раствора до 7,2-7,4.
- Доведите до объема 100 мл дистиллированной водой.
Хранить при температуре 4 ° С, и использовать в течение 1 недели. Порции могут храниться при -20 ° С в течение 1 месяца. Центрифуга кратко после оттаивания, чтобы удалить осадок.
- Блок Решение (10 мл)
- Добавить 9,4 мл PBS -.
- Добавить 0,6 мл сыворотки в PBS -. (Это, возможно, должны быть оптимизированы для каждого антитела).
Хранить при температуре 4 ° С, и использовать в течение 48 часов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Частичное финансирование для этой работы была предоставлена NSF-КАРЬЕРА 0744556 (Rao) и стипендий через VCU-HHMI образования, науки и исследовательской программы (Паскаль).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab Tek Permanox Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 117437 | Material for re-used plastic slides |
| Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 0.1-10μL Filter Tips | USA Scientific, Inc. | 1121-3810 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 120542-B | |
| Cytoseal 280 | Richard-Allan Scientific | 8311-4 | Mounting Medium |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 10000C | |
| Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody | EMD Millipore | MAB4304 | Primary Antibody for SSEA-4 staining |
| Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody | EMD Millipore | MAB4303 | Primary Antibody for SSEA-3 staining |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A11029 | Secondary Antibody for SSEA-4 staining |
| Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG | Invitrogen | A11006 | Secondary Antibody for SSEA-3 staining |
| DAPI, Dihydrochloride | Calbiochem | 268298 |
References
- Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. Cell surface markers in human embryonic stem cells. Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).
- Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R.
