Self-Made sitospin Aparatı kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücre İmmünositokimyasal Analizi

Summary

Gözlem ve ölçümü için bir tek tabaka hücreleri oluşturmak için bir self-made sitospin cihazların kullanımı dayalı, insan pluripotent kök hücreleri hücre yüzey belirteçleri için Süspansiyon immünositokimyasal boyama (hPSCs) (SSEA-3/SSEA-4) elde edildi.

Abstract

Insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve insan kaynaklı pluripotent kök hücreleri (hiPSCs) İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSCs) sınırsız kendini yenileme yetenekleri ve çok sayıda hücre tipleri ayırt etmek için potansiyel nedeniyle heyecan verici hücre kaynaklarıdır. HPSCs pluripotent devlet qPCR, immünsitokimya gibi teknikler genellikle değerlendirilen ve diğer

Protocol

Bölüm 1: Süspansiyon İmmünositokimyasal Boyama

1. Hücreler tek bir hücre süspansiyonu hasat edilir.
2. Bu hücreler daha sonra 1.5 2mL mikrosantrifüj tüpler aktarılır ve 200g 4 dakika santrifüj.
3. Hücreler supernatant dışarı aspire tarafından yıkanır, PBS 1mL yeniden askıya - (Mg ² olmadan ⁺ ve Ca ^{2 +)} ve sonra 4 dakika için 200 gr tekrar santrifüj. Bu iki kez yapılmalıdır.
4. Yıkadıktan sonra, hücreler daha sonra yeniden askıya onlara 10 dakika boyunca oda sıcaklığında 1 ml% 4 paraformaldehid (PFA) tarafından sabitlenir.
5. Hücreler iki kez 1ml PBS tekrar yıkanır.
6. Yıkama, blok hücreleri sonra yeniden askıya Blok Çözüm 1 ml (% 6 serum/94% PBS). 45 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
7. 200 gr az 4 dakika sonra, tüpler santrifüj ve Blok Çözüm aspirat. Primer antikor çözeltisi (Blok Çözüm tavsiye seyreltme ile yapılan) 1ml hücreleri yeniden askıya. Hücreler ya 1 saat veya 4 ° C'de bir gece bir sonraki adıma geçmeden önce oda sıcaklığında inkübe edilebilir.
8. Hücreler daha sonra Blok Çözüm 1mL ile iki kez yıkanır.
9. Sekonder antikoru çözümü (tavsiye edilen seyreltme Blok Çözüm ile yapılan) ve oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe 1mL hücreleri yeniden askıya sonra.
10. 1 saat sonra, hücreler daha sonra Blok Çözüm 1mL ile iki kez tekrar yıkanmış olmalıdır.
11. Blok Çözüm ile yıkadıktan sonra, 1 ml PBS ile tekrar hücreleri yıkayın.
12. Çeşitli yıkar sonra, 1 ml hücrelerin yeniden askıya DAPI nükleer leke (PBS içinde DAPI 1:10,000 seyreltme -) ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
13. 5 dakika sonra, 4 dakika için 200 gr tüpler santrifüj. - 1 ml PBS DAPI nükleer leke çözüm ve yeniden askıya hücreleri aspire.

HPSCs Incorporation Bölüm 2: sitospin aparatı sayesinde üretilen slaytlar

1. Plastik slaytlar, bir matkap basın delik istenilen miktarda yaparak hazırlanıyor. Kullanılmak üzere geniş çaplı mikropipet ucu (ler) den en fazla 1 mm daha geniş çaplı olması gerekir.
2. Filtre kağıdı, makas ile plastik slayt parametreleri kesilir.
3. Delik sonra filtre kağıdı yapılır. Deliğin boyutu (ler) mikropipet ucu (ler) aracılığıyla snuggly oturduğundan emin yeterince büyük olmalıdır.
4. Sonra, hazırlanan plastik slaytlar bir üst ve alt kesilmiş filtre kağıdı (Şekil 1) yerleştirilmiş bir cam slayt üzerine yerleştirilir. Katmanları bant ile sabitlenir.
5. Bölüm 1 lekeli hücre süspansiyonu 100μL maksimum (istenilen tek tabaka yoğunluğuna bağlı olarak) daha sonra mikropipet ucu (lar) üstüne yerleştirilir.
6. Gerekirse, cihazı hücre çözümü ile tartılır ve benzer ağırlıkta bir karşı denge oluşturulmuş.
7. Sitospin aparatı ve dengelemek sonra bir masaüstü santrifüj yerleştirilir ve 200g 4 dakika santrifüj yapabilirsiniz.
8. Santrifüj sonra, sitospin aparat dikkatle cam slayt hücreler yerinden doesnt bir şekilde demonte.
9. Gerekirse, aşırı çevreleyen PBS - cam tarafında aspire.
10. Hücreler daha sonra istediğiniz hücreye tek tabaka elde edilip edilmediğini kontrol etmek için bir floresan mikroskop kullanılarak görülebilir.

Bölüm 3: Montaj slaytlar

1. Bir damla istenen montaj medya hücreleri içeren her bölgenin merkezinde yer almaktadır.
2. Sonra, mümkünse hava kabarcıklarını önlemek için çalışıyoruz Slaytlarınıza bir kapak kayma yavaşça indirilir.
3. Aşırı montaj medya sonra slayt kaldırılır.
4. Sonra, kapak fişleri iki tırnak cilası ile mühürlenir.
5. Slaytlar sonuçları gözlemlenen ve belgelenen kadar karanlık bir depolama alanı saklanabilir.

Discussion

Laboratuvar amaçları için, 35mm, fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) yetişen kök hücre kültürleri bir çanak immünositokimyasal boyama prosedürü için sitospin aparatı ile kullanım için ayrılmıştır. Hücreler daha sonra bir tek hücre süspansiyonu, MEF katmanı mümkün olduğu kadar çok kaldırarak, Pasajlanması enzimatik yoluyla tahsil edilir. MEF katman daha etkili kök hücre izolasyonu isteniyorsa, koloniler elle süspansiyon içine sindirilmiş sonra aldı olabilir. Besleyici ücretsiz koşulları kök hücre kültürleri büyüyen kullanılırsa, koloniler sadece kazınmış ve süspansiyon içine sindirilmiş olabilir. Ilk tek hücreli bir süspansiyon ideal olsa da, herhangi bir hücre kümeleri immünositokimyasal boyama işlemi olarak adlandırılan çok sayıda yıkama ve yeniden süspansiyon adımları boyunca etkili parçalarına ayrılmış olmalıdır.

Video boyama hPSCs için ekstrasellüler belirteçlerin kullanımı üzerinde duruldu. HPSCs intraselüler boyanması isteniyorsa, Blok Çözüm toplamadan önce (Adım 1.6) ek bir adım hücreleri Permeabilization Çözüm 1 ml yıkanır neyin (Tween 20 25μL Yüksek Tuz Tampon 50mLs) üç kez yapılması gerekir önce yeniden askıya Blok Çözüm. Bir diğer kritik nokta belirtilmelidir prosedürü 1.9 Adım floresan ikincil antikor DAPI nükleer ağartma ve leke önlemek için numune ışığa maruz kalma en aza indirilmesinde, bakım alınması gerektiğini.

Çünkü çok sayıda yıkama ve prosedürü yeniden süspansiyon adımları, yaklaşık 400k-600k hücreleri olduğu tahmin geçit hazır kök hücre kolonileri, iyi bir miktarı ile bütün bir 35mm çanak, ilk süspansiyon sindirilmiş olması önerilir ve kullanılır . Bu prosedürün doğası nedeniyle bazı hücre kaybı beklentisiyle yapılır. Teorik olarak, hücreler çok daha küçük bir miktarı ilk süspansiyon kullanılan olabilir, ancak bakım, fazladan bir miktar daha fazla hücre kaybını en aza indirmek için alınması gereken. Immünositokimyasal boyama prosedüründen sonra sitospin aparat üzerine yüklerken, 10k-50k bir hücre yoğunluğu idealdir. Ideal bir hücre yoğunluğu içeren önerilir 100μL 0.1μL 10μL mikropipet ucu kullanan bir Cytopsin aparat üzerine yüklenebilecek maksimum miktar, daha küçük bir miktarı (yaklaşık 30μL 20μL) ise, belirtilmelidir. Bu cam slayt üzerine sıvı gereksiz taşması en aza indirir. Son olarak, santrifüj sitospin cihazları kullanırken, uzun aparat, lateral hareket, kuvvet, bildiğimiz kadarıyla, çalışırken santrifüj tarafından oluşturulan saygısız veya düşme aparat tutmak yeterli güvenli olarak.

Immünositokimyasal prosedüründe kullanılan çözümler için Malzemeler:

1. % 2 Paraformaldehit (PFA) / 2% Sakkaroz
   1. 75 ml distile su ve yer ekle ısıtmalı heyecan plaka üzerinde 56 ° C
   2. 2 g PFA tartılır ve cam beher ekleyin.
   3. 2 g sakaroz tartılır ve cam beher PFA eklemek.
   4. 1M sodyum hidroksit 2 damla ekleyin.
   5. Tüm reaktifler çözüm içine geçti sonra, 10 ml 10X PBS eklemek + +.
   6. PH 7,2-7,4 için çözüm ayarlayın.
   7. 100 ml saf su ile hacim kazandırın.
      Saklayınız 4 ° C ve 1 hafta içinde kullanmak. @ -20 ° C Alikot 1 ay saklanabilir. Herhangi bir çökelti kaldırmak için çözülme sonra kısaca santrifüjleyin.
2. Blok Çözümü (10 ml)
   1. 9.4 ml PBS ekle.
   2. PBS için 0.6 ml serum ekle. (Bu her bir antikor için optimize edilmesi gerekebilir.)
      Saklayınız 4 ° C ve 48 saat içinde kullanılacak.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab Tek Permanox Chamber Slide	Thermo Fisher Scientific, Inc.	117437	Material for re-used plastic slides
Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned	Fisher Scientific	12-550-15
0.1-10μL Filter Tips	USA Scientific, Inc.	1121-3810
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	120542-B
Cytoseal 280	Richard-Allan Scientific	8311-4	Mounting Medium
DPBS	GIBCO, by Life Technologies	14190
Normal Goat Serum	Invitrogen	10000C
Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody	EMD Millipore	MAB4304	Primary Antibody for SSEA-4 staining
Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody	EMD Millipore	MAB4303	Primary Antibody for SSEA-3 staining
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG	Invitrogen	A11029	Secondary Antibody for SSEA-4 staining
Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG	Invitrogen	A11006	Secondary Antibody for SSEA-3 staining
DAPI, Dihydrochloride	Calbiochem	268298