Summary
Detta protokoll beskriver ett arbetsflöde från ex vivo eller in vitro cellkulturer till transkriptomisk förbehandling av data för kostnadseffektiv transkriptombaserad läkemedelsscreening.
Abstract
Transkriptomik gör det möjligt att få omfattande insikter i cellulära program och deras svar på störningar. Trots en betydande minskning av kostnaderna för biblioteksproduktion och sekvensering under det senaste decenniet är det fortfarande oöverkomligt dyrt att tillämpa denna teknik i den skala som krävs för läkemedelsscreening, vilket hindrar den enorma potentialen hos dessa metoder. Vår studie presenterar ett kostnadseffektivt system för transkriptombaserad läkemedelsscreening, som kombinerar miniatyriserade störningskulturer med mini-bulktranskriptomik. Det optimerade mini-bulk-protokollet ger informativa biologiska signaler på kostnadseffektivt sekvenseringsdjup, vilket möjliggör omfattande screening av kända läkemedel och nya molekyler. Beroende på vald behandling och inkubationstid kommer detta protokoll att resultera i sekvenseringsbibliotek inom cirka 2 dagar. På grund av flera stopppunkter inom detta protokoll kan biblioteksförberedelsen, såväl som sekvenseringen, utföras tidsoberoende. Det är möjligt att bearbeta ett stort antal prover samtidigt. Mätning av upp till 384 prover testades utan förlust av datakvalitet. Det finns inte heller några kända begränsningar för antalet tillstånd och/eller läkemedel, trots att man tar hänsyn till variabilitet i optimala inkubationstider för läkemedel.
Introduction
Utvecklingen av nya läkemedel är en komplex och tidskrävande process som innebär att identifiera potentiella läkemedel och deras mål, optimera och syntetisera läkemedelskandidater och testa deras effektivitet och säkerhet i prekliniska och kliniska prövningar1. Traditionella metoder för läkemedelsscreening, dvs. systematisk utvärdering av bibliotek av kandidatföreningar för terapeutiska ändamål, involverar användning av djurmodeller eller cellbaserade analyser för att testa effekterna på specifika mål eller vägar. Även om dessa metoder har varit framgångsrika när det gäller att identifiera läkemedelskandidater, har de ofta inte gett tillräckliga insikter om de komplexa molekylära mekanismer som ligger till grund för läkemedelseffekt och även toxicitet och mekanismer för potentiella biverkningar.
Att bedöma transkriptionstillstånd i hela genomet är ett kraftfullt tillvägagångssätt för att övervinna nuvarande begränsningar i läkemedelsscreening, eftersom det möjliggör omfattande bedömningar av genuttryck som svar påläkemedelsbehandlingar. Genom att mäta RNA-transkript på ett genomomfattande sätt som uttrycks vid en given tidpunkt, syftar transkriptomik till att ge en helhetsbild av de transkriptionsförändringar som uppstår som svar på läkemedel, inklusive förändringar i genuttrycksmönster, alternativ splitsning och icke-kodande RNA-uttryck3. Denna information kan användas för att bestämma läkemedelsmål, förutsäga läkemedelseffekt och toxicitet och optimera läkemedelsdosering och behandlingsregimer.
En av de viktigaste fördelarna med att kombinera transkriptomik med opartisk läkemedelsscreening är möjligheten att identifiera nya läkemedelsmål som inte tidigare har övervägts. Konventionella metoder för läkemedelsscreening fokuserar ofta på etablerade målmolekyler eller målvägar, vilket hindrar identifieringen av nya mål och potentiellt resulterar i läkemedel med oförutsedda biverkningar och begränsad effektivitet. Transkriptomik kan övervinna dessa begränsningar genom att ge insikter i de molekylära förändringar som uppstår som svar på läkemedelsbehandling, vilket avslöjar potentiella mål eller vägar som kanske inte tidigare har övervägts2.
Förutom identifiering av nya läkemedelsmål kan transkriptomik också användas för att förutsäga läkemedels effekt och toxicitet. Genom att analysera de genuttrycksmönster som är associerade med läkemedelssvar kan biomarkörer utvecklas som kan användas för att förutsäga en patients svar på ett visst läkemedel eller behandlingsregim. Detta kan också bidra till att optimera läkemedelsdoseringen och minska risken för negativa biverkningar4.
Trots dess potentiella fördelar är kostnaden för transkriptomik fortfarande ett betydande hinder för dess utbredda tillämpning vid läkemedelsscreening. Transkriptomisk analys kräver specialiserad utrustning, teknisk expertis och dataanalys, vilket kan göra det utmanande för mindre forskargrupper eller organisationer med begränsad finansiering att använda transkriptomik i läkemedelsscreening. Kostnaden för transkriptomik har dock stadigt minskat, vilket gör det mer tillgängligt för forskarsamhället. Dessutom har framsteg inom teknik och dataanalysmetoder gjort transkriptomiken mer effektiv och kostnadseffektiv, vilket ytterligare ökar tillgängligheten2.
I detta protokoll beskriver vi ett högdimensionellt och explorativt system för transkriptombaserad läkemedelsscreening, som kombinerar miniatyriserade störningskulturer med mini-bulk transkriptomikanalys 5,6. Med detta protokoll är det möjligt att minska kostnaden per prov till 1/6av den nuvarande kostnaden för kommersiella lösningar för mRNA-sekvensering i full längd. Protokollet kräver endast standardlaboratorieutrustning, det enda undantaget är användningen av kortläsningssekvenseringsteknik, som kan läggas ut på entreprenad om sekvenseringsinstrument inte finns tillgängliga internt. Det optimerade mini-bulk-protokollet ger informationsrika biologiska signaler på kostnadseffektivt sekvenseringsdjup, vilket möjliggör omfattande screening av kända läkemedel och nya molekyler.
Syftet med experimentet är att screena för läkemedelsaktivitet på PBMC i olika biologiska sammanhang. Detta protokoll kan tillämpas på alla biologiska frågor där flera läkemedel bör testas med en transkriptomisk avläsning, vilket ger en transkriptomomfattande bild av den cellulära effekten av behandlingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll följer riktlinjerna från de lokala etiska kommittéerna vid universitetet i Bonn.
1. Förberedelse av buffertar, lösningar och utrustning
- Förbered lösningarna och samla ihop de material som beskrivs i materialförteckningen.
- Värm upp vattenbadet till 37 °C och värm upp hela odlingsmediet (RPMI-1640 + 10 % fetalt kalvserum (FCS) + 1 % penicillin/streptomycin).
- För cellskörd, använd iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
OBS: Håll en ren miljö när du arbetar med celler för att bibehålla steriliteten.
2. Hantering av celler
OBS: Ett detaljerat protokoll för kryokonservering av mononukleära celler i perifert blod (PBMC) från humant blod finns i7.
- Upptining och räkning av celler
- Ta bort kryovialerna från flytande kväve och tina dem i ett vattenbad vid 37 °C i 2-3 minuter medan du försiktigt vänder dem upp och ner.
- Överför de tinade cellerna till ett 50 ml koniskt rör.
- Skölj kryovialen med 1 ml varmt komplett odlingsmedium och tillsätt denna lösning droppvis till cellerna i röret (1:a spädningssteget).
- Upprepa spädningen 1:1 tills du når en volym på 32 ml (totalt 5 spädningar med 1, 2, 4, 8 respektive 16 ml varmt komplett odlingsmedium). Tillsätt mediet droppvis för att minska cellstörningen samtidigt som du rör om det koniska röret något.
- Centrifugera cellsuspensionen i 5 minuter (300 x g, 20 °C) och avlägsna supernatanten genom att försiktigt tippa det koniska röret i en flytande rörelse.
- Återsuspendera cellerna i 3 ml varmt komplett odlingsmedium och fortsätt med cellräkningen.
- Blanda 10 μl cellsuspension med trypanblått (spädning 1:2 till 1:10 beroende på cellsuspensionens densitet) för att skilja levande från döda celler under räkningen. Döda eller skadade celler kommer att se blå ut på grund av upptaget av färgämnet, medan vitala celler inte färgas.
OBS: Trypan Blue är lätt cytotoxiskt, färgade celler bör inte förvaras i mer än 5 min. - Räkna cellerna med antingen en automatiserad cellräknare eller räknekammare med hjälp av 10 μL färgad celllösning.
- När du använder den Neubauer-förbättrade cellkammaren, räkna alla celler inom de fyra stora rutorna i hörnen och använd följande ekvation för att beräkna koncentrationen av cellsuspensionen.
- När du använder den Neubauer-förbättrade cellkammaren, räkna alla celler inom de fyra stora rutorna i hörnen och använd följande ekvation för att beräkna koncentrationen av cellsuspensionen.
- Späd cellerna till en slutlig koncentration av 1 x 106 celler/ml med varmt komplett odlingsmedium. Centrifugera endast om den erforderliga volymen är lägre än 3 ml och återsuspendera cellpelleten till rätt volym.
- Cellsådd och behandling
- Frö 100 μL cellsuspension per brunn i en cellodlingsplatta med 96 brunnar (1 x 105 celler/brunn).
OBS: Cellnumret för sådd optimerades för PBMC-kulturer. Även om låga cellkoncentrationer inte kommer att ge en tillräcklig mängd RNA för sekvensering, kommer ett överdrivet antal celler att öka risken för suboptimal celllys och hämning av den omvända transkriptionsreaktionen. - Bered läkemedelsspädningar med en koncentration som är två gånger högre än den som används för behandling (2x). Välj lösningsmedel efter föreningens löslighet, helst komplett odlingsmedium.
OBS: PBS eller dimetylsulfoxid (DMSO) kan användas om tillräcklig löslighet inte kan uppnås på annat sätt. Den maximala koncentrationen av DMSO i den resulterande inkubationsvolymen bör inte överstiga 0,5 % för att förhindra cytotoxicitet inducerad av lösningsmedlet. - Tillsätt 100 μl av 2x-utspädningen (slutlig koncentration i brunn 1X) och inkubera vid 37 °C under den definierade tiden.
Kompletterande undersökningar bör utföras för att fastställa den optimala inkubationstiden för läkemedlet och för att utesluta potentiella mekanismer för cytotoxicitet.
- Frö 100 μL cellsuspension per brunn i en cellodlingsplatta med 96 brunnar (1 x 105 celler/brunn).
- Cellskörd och lys
- Centrifugera cellodlingsplattan i 10 minuter (300 x g, 20 °C). Ta försiktigt bort supernatanten med en vakuumpump och håll plattan i en vinkel (30°-45°) samtidigt som du riktar spetsen mot brunnens nedre hörn för att ta bort så få celler som möjligt.
- Tvätta cellerna genom att tillsätta 200 μl iskall PBS till varje brunn och centrifugera plattan i 5 minuter (300 x g, 4 °C). Ta bort supernatanten med en vakuumpump igen, håll plattan i en skarp vinkel för att ta bort så mycket PBS som möjligt.
- Bered lyseringsbufferten enligt beskrivningen i tabell 1 för det antal reaktioner (rxn) som behövs, med tillsats av 10 % överskott.
- Tillsätt 15 μL lysbuffert till varje brunn och försegla plattan med självhäftande tätningsfilm för att skydda proverna mot kontaminering. Skölj plattan före centrifugering i 1 minut (1000 x g, 4 °C) och inkubera i 5 minuter på is.
- Samla upp 6 μl lyserad celllösning i en PCR-platta och frys celllysatet kort vid -80 °C för att säkerställa optimal celllys. Se till att undvika flera fryscykler av plattorna.
OBS: STOPPPUNKT: Om cDNA-produktion inte utförs därefter kan celllysatet lagras vid -80 °C i upp till flera månader utan betydande försämring av RNA-kvaliteten.
3. Biblioteksförberedelse för sekvensering
- Reaktion på omvänt transkriptas (RT)
OBS: När du arbetar med RNA, placera alla samples på is och se till att använda nukleasfri utrustning (sterila engångsplastartiklar) och vatten.- Bered RT-reaktionsblandningen enligt beskrivningen i tabell 2 för det antal reaktioner som behövs, lägg till 10 % överskott. Virvla blandningen kort och snurra den kort. Förvara blandningen på is tills den ska användas.
- Tina celllysatet vid rumstemperatur (RT) och snurra det kort ner för att samla upp allt celllysat i botten av plattan.
- Utför mRNA-denaturering på en termocykler enligt tabell 3.
- Ta ut plattan ur termocyklern och snurra den kort nedåt för att samla upp eventuellt kondensat. Tillsätt 6 μL RT-reaktionsblandning i varje brunn för en slutlig volym på 12 μL. Försegla plattan för att skydda plattan och för att undvika avdunstning, virvel och snurra ner den.
- Placera plattan på termocyklern och starta RT-reaktionsprogrammet enligt tabell 3.
- Förförstärkning
- Tina DNA-polymeras och ISPCR-primer ( in-situ PCR) vid rumstemperatur.
- Förbered förförstärkningsblandningen enligt tabell 4 för det antal reaktioner som behövs, lägg till 10 % överskott. Blanda blandningen kort och snurra ner den.
OBS: Enzymblandningen är stabil vid rumstemperatur i timmar. - Snurra ner PCR-plattan, tillsätt 15 μL av förförstärkningsblandningen till varje brunn och försegla plattan.
- Placera den på termocyklern och starta förförstärkningsreaktionen enligt tabell 5.
- Justera antalet cykler på grund av RNA-innehåll. Börja med en lägre siffra och öka om cDNA-utbytet inte är tillräckligt.
OBS: Enligt vår erfarenhet bör optimalt antal cykler fastställas för varje celltyp, experimentellt tillstånd och behandling kommer inte att påverka det optimala antalet cykler. Vi rekommenderar därför att du fastställer det optimala antalet cykler experimentellt när du upprättar detta protokoll för en ny celltyp. I allmänhet kommer primära celler att kräva ett högre antal cykler jämfört med cellinjer. STOPPPUNKT: Förförstärkningsprodukten kan förvaras vid -20 °C.
- Justera antalet cykler på grund av RNA-innehåll. Börja med en lägre siffra och öka om cDNA-utbytet inte är tillräckligt.
- cDNA-sanering och kvalitetskontroll (QC)
OBS: Sample rengöring kan utföras sekventiellt för varje platta eftersom samples är ganska stabila i detta skede. Att öka antalet prover kommer att leda till en längre varaktighet för protokollet men kommer inte att begränsa antalet prover som kan bearbetas samtidigt.- Innan du börjar, ta de magnetiska reningspärlorna till rumstemperatur och virvla på hög hastighet i 1 minut för att helt återsuspendera pärlorna.
- Tillsätt 0,8 x v/v (20 μL) magnetiska reningspärlor till varje brunn och inkubera i rumstemperatur i 5 minuter.
- Placera PCR-plattan på ett magnetställ i 5 minuter tills pärlorna är helt separerade. Ta försiktigt bort supernatanten.
- Håll plattan på magnetstället, tillsätt försiktigt 100 μL nyberedd 80 % etanol för att tvätta pärlorna och inkubera i 30 s. Använd en pipett med liten volym för att ta bort supernatanten. Upprepa för ytterligare ett tvättsteg. Se till att ta bort så mycket etanol som möjligt.
- Lufttorka pärlorna på magnetstället i rumstemperatur i upp till 5 minuter tills etanolen är helt avdunstad och pärlorna inte längre ser glänsande ut.
- Ta bort plattan från magnetstället, suspendera pärlorna i 20 μL nukleasfritt vatten och inkubera i 2 minuter.
- Placera plattan igen på magnetstället tills pärlorna är separerade.
- Återvinn eluatet i en ny PCR-platta för cDNA, QC och tagmentation.
- Utför en TapeStation- eller FragmentAnalyzer-analys för att utvärdera storleksfördelningen och koncentrationen av cDNA-biblioteket (rekommenderas: TapeStation D5000-analys). Mer information finns i tillverkarens instruktioner. En typisk avkastning på 20 ng kan förväntas.
- Märkning med kit
OBS: Andra Tagmentation-protokoll kan användas om de redan är etablerade.- Späd cDNA till en slutlig koncentration på 150 - 300 pg/μL med nukleasfritt vatten.
- Förprogrammera termocyklern enligt tabell 6 för att säkerställa en omedelbar start av tagmentationsreaktionen efter tillsats av cDNA till enzymblandningen.
- Förbered tagmentationsblandningen enligt tabell 7 för det antal reaktioner som behövs, lägg till 10 % överskott.
- Fördela 3 μl av tagmentationsblandningen per reaktion på en ny PCR-platta och tillsätt 1 μL cDNA till varje reaktion.
- Starta tagmentationsreaktionen omedelbart efter att du har lagt till cDNA.
- Inaktivera reaktionen genom att tillsätta 1 μL neutraliseringsbuffert (NT; alternativt kan 0,2 % natriumdodecylsulfat (SDS) användas).
- Berikning PCR
- Bered anriknings-PCR-blandningen Tabell 7 för antalet reaktioner, lägg till 10 % överskott. (Rekommenderas: Nextera UDI inställd för att förhindra indexhoppning på mönstrade flödesceller (t.ex. Illumina NovaSeq 6000)).
- Tillsätt 9 μl av anriknings-PCR-blandningen till varje reaktion för en total volym på 14 μL.
- Kör PCR-programmet för berikning enligt tabell 8.
OBS: För anriknings-PCR är 16 cykler standard. Om cDNA-kvaliteten är dålig kan ytterligare cykler läggas till.
- Rensning och QC
- Innan du börjar, ta med magnetiska reningspärlor till rumstemperatur och virvla på hög hastighet i 1 minut för att helt återsuspendera pärlorna.
- Tillsätt 1,0x v/v (14 μL) magnetiska reningspärlor och inkubera i rumstemperatur i 5 min.
- Placera plattan på ett magnetställ och vänta i 5 minuter tills pärlorna är helt separerade. Ta försiktigt bort supernatanten.
- Håll plattan på magnetstället, tillsätt försiktigt 100 μL nyberedd 80 % etanol för att tvätta pärlorna och inkubera i 30 s. Använd en pipett med liten volym för att ta bort supernatanten. Upprepa för ytterligare ett tvättsteg. Se till att ta bort så mycket etanol som möjligt.
- Lufttorka pärlorna i rumstemperatur i 3 minuter eller tills de inte längre ser blanka ut.
- Ta bort plattan från magnetstället, suspendera pärlorna i 20 μL nukleasfritt vatten och inkubera i 2 minuter.
- Placera plattan igen på magnetstället tills pärlorna separeras och samla in eluatet i en ny PCR-platta för bibliotek QC.
- Utför en TapeStation eller Fragment Analyzer-analys för att utvärdera storleksfördelningen och koncentrationen av cDNA-biblioteket (rekommenderas: TapeStation D1000 högkänslig analys). Mer information finns i tillverkarens instruktioner. I genomsnitt kan man förvänta sig en avkastning på 10 ng.
OBS: STOPPPUNKT: PCR-produkten kan förvaras vid -20 °C.
4. Sekvensering och förbehandling av data
- Sekvensering
OBS: Följande riktlinje kommer att gälla för alla Illumina-instrument för kortläsningssekvensering. Om instrumenteringen inte är tillgänglig kan sekvenseringen utföras av en extern sekvenseringsanläggning. Andra sekvenseringsmetoder kan också användas. För enkelhetens skull valde vi att endast rapportera om den mest använda sekvenseringstekniken.
OBS: Följande steg relaterade till programvaruanvändning beskriver proceduren på en Illumina NovaSeq6000 sequencer.- Poola unikt indexerade bibliotek i ett ekvimolärt förhållande enligt resultaten från steg 3.6.8.
- Mät koncentrationen i den slutliga poolen med en högkänslig analys för att beräkna provets molaritet enligt följande:
- Ladda flödescellen enligt instrumentets specifikation och till experimentell optimering. Exempel på belastningskoncentrationer för vanliga instrument visas i tabell 9.
- Genom att trycka på skärmen väljer du Sekvens för att initiera körningsinställningen.
- Följ instruktionerna på skärmen och lastflödescellen, sekvens-för-syntes-patronen, klustringspatronen, buffertpatronen och se till att avfallsbehållarna är tomma.
- När alla reagenser har identifierats av instrumentet klickar du på Kör installation. Definiera här körningsnamnet och utdatamappen för att lagra data.
- Definiera sekvenseringsinformationen som parad ände med båda läsningarna på 51 bp. Två indexavläsningar sekvenseras också med 8 bp vardera.
- Tryck på Granska och efter att ha kontrollerat om alla sekvenseringsdetaljer är korrekta, tryck på Starta körning.
OBS: Det rekommenderade sekvenseringsdjupet är 5 x 106 läsningar/sample, med minst 1 x 106 läsningar/sample.
- Förbehandling av data
- Transformera råsekvenseringsdata till FASTQ-format och demultiplex enligt exempelindexen med verktyget Bcl2Fastq2. Utför demultiplexering med standardinställningar. För detaljerade instruktioner om Bcl2Fastq2, se referensmanualen.
OBS: FASTQ-konvertering och demultiplexering utförs vanligtvis av sekvenseringsanläggningen om sekvensering inte utförs internt. Sekvenseringsanläggningar tillhandahåller vanligtvis demultiplexerad FASTQ för vidare bearbetning. - Det finns flera alternativ för datajustering och kvantifiering av förekomst av sekvenseringsläsningar (rekommenderas: nf-core RNA-seq pipeline (https://nf-co.re/rnaseq)). Pipelinen innehåller flera alternativ, använd standardinställningen med STAR8 som justerad och Salmon9 för att kvantifiera transkriptionsmängden.
- OBS: För ytterligare bioinformatisk analys finns flera metoder tillgängliga. Det ingår inte i omfånget för detta protokoll för att täcka alla (rekommenderas: DEseq2 pipeline10). Ett standardskript baserat på DEseq2-arbetsflödet som utvecklats av oss finns på GitHub (https://github.com/jsschrepping/RNA-DESeq2).
- Transformera råsekvenseringsdata till FASTQ-format och demultiplex enligt exempelindexen med verktyget Bcl2Fastq2. Utför demultiplexering med standardinställningar. För detaljerade instruktioner om Bcl2Fastq2, se referensmanualen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I enlighet med det rapporterade protokollet såddes humana PBMC, behandlades med olika immunmodulerande läkemedel och, efter olika inkubationstider, skördades för bulktranskriptomisk analys med hjälp av sekvenseringsprotokollet (Figur 1).
Ideala läkemedelskoncentrationer och inkubationstider för testföreningar bör identifieras uppströms detta protokoll med hjälp av kompletterande experimentella strategier och på grundval av den specifika vetenskapliga frågeställningen. I de flesta fall bör inkubation efter 2-4 timmar och 24 timmar ge en representation av tidiga och sena transkriptionssvar på behandlingen.
De viktigaste resultaten för att utvärdera de korrekta exekveringarna av protokollet är cDNA och bibliotekets QC:er (figur 2 och figur 3). cDNA-profilen bör ha en bred fördelning med en genomsnittlig storlek på > 1000 bp (Figur 2), en lägre genomsnittlig storlek eller ackumulering av molekyler vid låg molekylvikt (Figur 4) kan indikera en låg RNA-inmatning eller RNA-nedbrytning.
Förberedelsen av ett bra sekvenseringsbibliotek är också ett viktigt steg i protokollet; Post-tagmentation-bibliotek bör ha en ganska smal fördelning på cirka 250 bp (figur 3); längre fragment fungerar dåligt under sekvenseringen (figur 5).
Efter sekvensering justeras råa FASTQ-filer mot lämpligt referensgenom (t.ex. människa eller mus) och transkriptöverflödet kvantifieras för varje prov (se nf-core RNA-seq pipeline (https://nf-co.re/rnaseq)). Undersökande dataanalys kommer nu att utföras för att kontrollera den övergripande kvaliteten på data. Anpassade data bör fånga ett stort antal proteinkodande gener eftersom endast polyadenylerat RNA kommer att fångas upp med detta protokoll (figur 6A). I mänskliga prover förväntar vi oss att fånga mellan 15000 och 20000 transkript (detta värde är baserat på GENCODE 27-referensen human genome annotation11). Ytterligare undersökande dataanalys kan innefatta principalkomponentanalys (PCA). Här kan den underliggande strukturen för data visualiseras i ett tvådimensionellt diagram. I figur 6B visar vi ett exemplariskt PCA-diagram; Prickarna här är färgade av behandling och visar tre olika kluster av experimentella förhållanden som leder till liknande transkriptomiska profiler. Det kan också ses här att biologiska replikat (prickar med samma färg) är transkriptionellt lika, vilket visar på en god robusthet i protokollet. Resultaten som visas i den här bilden genererades med pipeline som är tillgänglig på GitHub baserat på DESeq2-arbetsflödet (https://github.com/jsschrepping/RNA-DESeq2).
Bild 1: Tidsuppskattningar och arbetsflöde. (A) Tidsuppskattningar av detta protokoll för en körning med 96 prover. (B) Diagram över varje steg i protokollet från upptining av cellerna till förbehandling av data. Diagrammet ska läsas uppifrån och ner efter pilarna. Inringade pilar beskriver en upprepning av steget. Röda prickar representerar stopppunkter som beskrivs närmare i protokollet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Exempelresultat för cDNA-bibliotek. Resultat av en miniatyriserad elektrofores som visar storleksfördelningen av exemplariskt cDNA-bibliotek. Övre och nedre signaler representerar markörer som används för att justera sample. Blå linjer anger de genomsnittliga fragmentstorlekarna (blå hakparenteser). cDNA-profilen visar en bred spridning med en genomsnittlig storlek på > 1000 bp. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 3: Exempel på resultat för sekvenseringsbibliotek. Resultat av en miniatyriserad elektrofores som visar storleksfördelningen av framgångsrikt preparerade sekvenseringsbibliotek med en smal fördelning och en genomsnittlig storlek på cirka 250 bp. Övre och nedre signaler representerar markörer som används för att justera sample. Blå linjer anger de genomsnittliga fragmentstorlekarna (blå hakparenteser). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Exempel på suboptimala resultat för cDNA-bibliotek. Resultat av en miniatyriserad elektrofores som visar storleksfördelningen av ett suboptimalt cDNA-bibliotek med en genomsnittlig storlek på < 200 bp. Övre och nedre signaler representerar markörer som används för att justera sample. Blå linjer anger de genomsnittliga fragmentstorlekarna (blå hakparenteser). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 5: Exempel på icke-optimala resultat för sekvenseringsbibliotek. Resultat av en miniatyriserad elektrofores som visar storleksfördelningen av ett suboptimalt sekvenseringsbibliotek innehållande längre fragment på 200 - 1000 bp. Övre och nedre signaler representerar markörer som används för att justera sample. Blå linjer anger de genomsnittliga fragmentstorlekarna (blå hakparenteser). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Undersökande dataanalys. Representativa resultat från explorativ dataanalys som visar effekten av utvalda immunmodulerande läkemedel på PBMC. (A) Stapeldiagram över antalet upptäckta gener (Y-axlar) separerade efter gentyp (X-axlar). (B) PCA av alla gener i datasetet färgade av de olika läkemedelsbehandlingarna. Prickar med samma färg är biologiska replikat. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Reagens | Koncentration | Volym [μL] /rxn |
| Guanidinhydroklorid | 80 mM | 7.50 |
| Deoxinukleotidtrifosfater (dNTP) | 10 mM vardera | 6.52 |
| SMART dT30VN primer | 100 μM | 0.33 |
| Nukleasfritt vatten | 0.65 | |
| Total volym | 15.00 |
Tabell 1: Lysbuffert.
| Reagens | Volym [μL] /rxn |
| SSRT II-buffert (5x) | 2.00 |
| DTT (100 mM) | 0.50 |
| Betainin (5 m) | 2.00 |
| MgCl2 (1 m) | 0.14 |
| SSRT II (200 U/μL) | 0.25 |
| RNAse-hämmare (40 E/μL) | 0.25 |
| TSO-LNA (100 μM) | 0.20 |
| Nukleasfritt vatten | 0.66 |
| Total volym | 6.00 |
Tabell 2: Reaktionsblandning för omvänt transkriptas (RT).
| mRNA-denaturering | ||
| Steg | Temperatur | Varaktighet |
| mRNA-denaturering | 95 °C | 2 minuter |
| på is | 2 minuter | |
| Omvänd transkription | ||
| Steg | Temperatur | Varaktighet |
| Omvänd transkription | 42 °C | 90 minuter |
| Inaktivering av enzymer | 70 °C | 15 minuter |
| 4 °C | hålla | |
Tabell 3: Termocykler för mRNA-denaturering och omvänt transkriptas (RT).
| Reagens | Volym [μL] /rxn |
| DNA-polymeras med hög tillförlitlighet | 12.50 |
| ISPCR-primer (10 μM) | 0.15 |
| Nukleasfritt vatten | 2.35 |
| Total volym | 15.00 |
Tabell 4: Blandning före förstärkning.
| Trappsteg | Temperatur | Varaktighet | |
| Inledande denaturering | 98 °C | 3 minuter | |
| Denaturering | 98 °C | 20 sek | 16 – 18 cykler |
| Glödgning | 67 °C | 20 sek | |
| Förlängning | 72 °C | 6 minuter | |
| 4 °C | hålla |
Tabell 5: Program för termocykler före förstärkning.
| Trappsteg | Temperatur | Varaktighet |
| Märkning | 55 °C | 8 minuter |
| 4 °C | hålla |
Tabell 6: Tagmentation termocykler program.
| Blandning av taggar | |
| Reagens | Volym [μL] /rxn |
| Amplicon Tagment Mix (ATM) | 1.0 |
| DNA-buffert (TD) | 2.0 |
| Total volym | 3.0 |
| Berikning PCR-blandning | |
| Reagens | Volym [μL] /rxn |
| DNA-polymeras med hög tillförlitlighet | 7.0 |
| Nextera-kompatibel indexeringsprimer | 2.0 |
| Total volym | 9.0 |
Tabell 7: Tagmentationsblandning och anriknings-PCR-blandning.
| Trappsteg | Temperatur | Varaktighet | |
| Varm start | 72 °C | 5 minuter | |
| Inledande denaturering | 98 °C | 30 sek | |
| Denaturering | 98 °C | 10 sek | 16 cykler |
| Glödgning | 60 °C | 30 sek | |
| Förlängning | 72 °C | 1 minut | |
| Slutlig förlängning | 72 °C | 5 minuter | |
| 4 °C | hålla |
Tabell 8: Anriknings-PCR-termocyklerprogram.
| Instrument | Laddar koncentration |
| MiSeq v2 | 10 pM |
| NästaSeq 500/550 | 1,4 pM |
| NovaSeq 6000 | 1250 pM |
Tabell 9: Exempel på belastningskoncentrationer för vanliga sekvenseringsinstrument.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Läkemedelsupptäckt och läkemedelsutveckling kan dra stor nytta av den helhetssyn på cellulära processer som bulktranskriptomik kan ge. Ändå begränsas detta tillvägagångssätt ofta av den höga kostnaden för experimentet med standard bulk RNA-seq-protokoll, vilket förbjuder dess tillämpning i akademiska miljöer såväl som dess potential för industriell skalbarhet.
De mest kritiska stegen i protokollet är cellupptining och de första stegen i biblioteksförberedelserna. Att säkerställa hög livskraft hos cellerna efter upptining är avgörande för framgångsrika behandlingar och transkriptomisk analys. De första stegen i cellskörden och biblioteksberedningen fram till cDNA-syntesen är avgörande för att bevara RNA:s integritet. Det är viktigt i detta skede att hålla celllysatet på is hela tiden och bearbeta proverna så snabbt som möjligt. Om överdriven RNA-nedbrytning observeras bör laboratorieytor och utrustning rengöras med specifika produkter för att hämma eventuell RNas-aktivitet.
Protokollet som beskrivs här är för närvarande optimerat för läkemedelsbehandling på PBMC från friska donatorer i högst 24 timmar. För att utföra experimentet med en annan celltyp eller för längre inkubationstid kan cellantalet för sådd- och odlingsförhållanden behöva optimeras i enlighet med detta.
Med detta protokoll tillhandahåller vi ett arbetsflöde för transkriptomisk analys vid läkemedelsbehandling på PBMC med hjälp av standardlaboratorieutrustning och inget behov av kommersiella kit. Med detta tillvägagångssätt och genom att undvika steget med RNA-rening minskade vi kostnaderna avsevärt och möjliggjorde parallell analys av ett stort antal föreningar.
Eftersom detta protokoll är baserat på en in vitro-analys är dess största begränsning att det inte kan utvärdera någon metabolisk bearbetning av läkemedlen som kan leda till olika bioaktivitet. Dessutom kommer antalet infångade transkriptioner och sekvenseringsdjup att vara lägre än i standardmetoder för transkriptomik i full längd, vilket förhindrar användning av dessa data för tillämpningar som kräver högre informationsinnehåll, såsom differentiell splitsning eller kvantifiering av enstaka nukleotidpolymorfismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna redovisar inga motstridiga intressen.
Acknowledgments
J.L.S. stöds av den tyska forskningsstiftelsen (DFG) enligt Tysklands excellensstrategi (EXC2151-390873048), samt under SCHU 950/8-1; GRK 2168, TP11; CRC SFB 1454 Metaflammation, IRTG GRK 2168, WGGC INST 216/981-1, CCU INST 217/988-1, det BMBF-finansierade excellensprojektet Diet-Body-Brain (DietBB); och EU-projektet SYSCID under bidragsnummer 733100. M.B. stöds av DFG (IRTG2168-272482170, SFB1454-432325352). L.B. stöds av DFG (ImmuDiet BO 6228/2-1 - projektnummer 513977171) och Tysklands Excellence Strategy (EXC2151-390873048). Bilder som skapats med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conical tube | fisher scientific | 10203001 | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Thermo Fisher Scientific | AB0558 | |
| Amplicon Tagment Mix (ATM) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A 63881 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 61962 | |
| Cell culture grade 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 260860 | |
| Cell culture vacuum pump (VACUSAFE) | Integra Bioscience | 158300 | |
| Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each | Fermentas | R0192 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| DTT (100 mM) | Invitrogen | 18064-014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | for adherent cells |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 51976 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Filter tips (10 µL) | Gilson | F171203 | |
| Filter tips (100 µL) | Gilson | F171403 | |
| Filter tips (20 µL) | Gilson | F171303 | |
| Filter tips (200 µL) | Gilson | F171503 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | G3272 | |
| ISPCR primer (10 µM) | Biomers.net GmbH | SP10006 | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′ |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnetic stand 96 | Ambion | AM10027 | |
| Neutralize Tagment (NT) Buffer | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS |
| Nextera-compatible indexing primer | Illumina | ||
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10977049 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| PCR 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB0600 | |
| PCR plate sealer | Thermo Fisher Scientific | HSF0031 | |
| Penicillin / Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Qubit 4 fluorometer | Invitrogen | 15723679 | |
| Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul) | TAKARA | 2313A | |
| RPMI-1640 cell culture medium | Gibco | 61870036 | If not working with PBMCs, adjust to cell type |
| SMART dT30VN primer | Sigma-Aldrich | 5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3 |
|
| Standard lab equipment | various | various | e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath |
| SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| Tagment DNA Buffer (TD) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
| TapeStation system 4200 | Agilent | G2991BA | |
| Thermocycler (S1000) | Bio-Rad | 1852148 | |
| TSO-LNA (100 uM) | Eurogentec | 5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G |
|
| Vortex-Genie 2 Mixer | Sigma-Aldrich | Z258415 |
References
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L.
- Yang, X., et al. High-throughput transcriptome profiling in drug and biomarker discovery. Front Genet. 11, 19 (2020).
- Bonaguro, L., et al. A guide to systems-level immunomics. Nat Immunol. 23 (10), 1412-1423 (2022).
- Carraro, C., et al. Decoding mechanism of action and sensitivity to drug candidates from integrated transcriptome and chromatin state. ELife. 11, 78012 (2022).
- Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nat Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).
- De Domenico, E., et al. Optimized workflow for single-cell transcriptomics on infectious diseases including COVID-19. STAR Protoc. 1 (3), 100233 (2020).
- Dobin, A., et al.
- Patro, R., et al. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nat Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- Frankish, A., et al. GENCODE reference annotation for the human and mouse genomes. Nucleic Acids Res. 47, D766-D773 (2019).
