Omkostningseffektiv transkriptomisk baseret lægemiddelscreening

Summary

Denne protokol beskriver en arbejdsgang fra ex vivo eller in vitro cellekulturer til transkriptomisk dataforbehandling til omkostningseffektiv transkriptombaseret lægemiddelscreening.

Abstract

Transcriptomics giver mulighed for at få omfattende indsigt i cellulære programmer og deres reaktioner på forstyrrelser. På trods af et betydeligt fald i omkostningerne til biblioteksproduktion og -sekventering i det seneste årti er det fortsat uoverkommeligt dyrt at anvende disse teknologier i det omfang, der er nødvendigt for lægemiddelscreening, hvilket hindrer disse metoders enorme potentiale. Vores undersøgelse præsenterer et omkostningseffektivt system til transkriptombaseret lægemiddelscreening, der kombinerer miniaturiserede forstyrrelseskulturer med mini-bulk transkriptomics. Den optimerede mini-bulk-protokol giver informative biologiske signaler ved omkostningseffektiv sekventeringsdybde, hvilket muliggør omfattende screening af kendte lægemidler og nye molekyler. Afhængigt af den valgte behandlings- og inkubationstid vil denne protokol resultere i sekventering af biblioteker inden for ca. 2 dage. På grund af flere stoppunkter inden for denne protokol kan bibliotekets forberedelse såvel som sekventering udføres tidsuafhængigt. Behandling samtidig af et stort antal prøver er mulig; Måling af op til 384 prøver blev testet uden tab af datakvalitet. Der er heller ingen kendte begrænsninger for antallet af tilstande og / eller lægemidler, på trods af at der tages hensyn til variabilitet i optimale lægemiddelinkubationstider.

Introduction

Udviklingen af nye lægemidler er en kompleks og tidskrævende proces, der involverer identifikation af potentielle lægemidler og deres mål, optimering og syntetisering af lægemiddelkandidater og test af deres effektivitet og sikkerhed i prækliniske og kliniske forsøg¹. Traditionelle metoder til lægemiddelscreening, dvs. systematisk vurdering af biblioteker af kandidatforbindelser til terapeutiske formål, involverer anvendelse af dyremodeller eller cellebaserede assays til at teste virkningerne på specifikke mål eller veje. Mens disse metoder har været vellykkede til at identificere lægemiddelkandidater, gav de ofte ikke tilstrækkelig indsigt i de komplekse molekylære mekanismer, der ligger til grund for lægemiddeleffektivitet og også toksicitet og mekanismer for potentielle bivirkninger.

Vurdering af genom-dækkende transkriptionelle tilstande præsenterer en stærk tilgang til at overvinde de nuværende begrænsninger i lægemiddelscreening, da det muliggør omfattende vurderinger af genekspression som reaktion på lægemiddelbehandlinger². Ved at måle RNA-transkripter på en genom-bred måde udtrykt på et givet tidspunkt sigter transkriptomics mod at give et holistisk billede af de transkriptionelle ændringer, der opstår som reaktion på lægemidler, herunder ændringer i genekspressionsmønstre, alternativ splejsning og ikke-kodende RNA-ekspression³. Disse oplysninger kan bruges til at bestemme lægemiddelmål, forudsige lægemiddeleffektivitet og toksicitet og optimere lægemiddeldosering og behandlingsregimer.

En af de vigtigste fordele ved at kombinere transkriptomics med upartisk lægemiddelscreening er potentialet til at identificere nye lægemiddelmål, der ikke tidligere er blevet overvejet. Konventionelle metoder til screening af lægemidler fokuserer ofte på etablerede målmolekyler eller -veje, hvilket hindrer identifikationen af nye mål og potentielt resulterer i lægemidler med uforudsete bivirkninger og begrænset effektivitet. Transcriptomics kan overvinde disse begrænsninger ved at give indsigt i de molekylære ændringer, der opstår som reaktion på lægemiddelbehandling, afdække potentielle mål eller veje, der måske ikke tidligere er blevet overvejet².

Ud over identifikation af nye lægemiddelmål kan transkriptomics også bruges til at forudsige lægemiddeleffektivitet og toksicitet. Ved at analysere genekspressionsmønstre forbundet med lægemiddelresponser kan der udvikles biomarkører, der kan bruges til at forudsige en patients respons på et bestemt lægemiddel eller behandlingsregime. Dette kan også bidrage til at optimere lægemiddeldosering og reducere risikoen for bivirkninger⁴.

På trods af dets potentielle fordele er omkostningerne ved transkriptomik fortsat en betydelig barriere for dets udbredte anvendelse i lægemiddelscreening. Transkriptomisk analyse kræver specialudstyr, teknisk ekspertise og dataanalyse, hvilket kan gøre det udfordrende for mindre forskerhold eller organisationer med begrænset finansiering at bruge transkriptomik i lægemiddelscreening. Imidlertid har omkostningerne ved transkriptomik været støt faldende, hvilket gør det mere tilgængeligt for forskersamfundene. Derudover har fremskridt inden for teknologi og dataanalysemetoder gjort transkriptomik mere effektiv og omkostningseffektiv, hvilket yderligere øger tilgængeligheden².

I denne protokol beskriver vi et højdimensionelt og udforskende system til transkriptombaseret lægemiddelscreening, der kombinerer miniaturiserede forstyrrelseskulturer med mini-bulk transkriptomics-analyse ^5,6. Med denne protokol er det muligt at reducere omkostningerne pr. prøve til 1/6^af de nuværende omkostninger ved kommercielle løsninger til mRNA-sekventering i fuld længde. Protokollen kræver kun standard laboratorieudstyr, den eneste undtagelse er brugen af kortlæste sekventeringsteknologier, som kan outsources, hvis sekventeringsinstrumenter ikke er tilgængelige internt. Den optimerede mini-bulk-protokol giver informationsrige biologiske signaler ved omkostningseffektiv sekventeringsdybde, hvilket muliggør omfattende screening af kendte lægemidler og nye molekyler.

Formålet med forsøget er at screene for lægemiddelaktivitet på PBMC'er i forskellige biologiske sammenhænge. Denne protokol kan anvendes på ethvert biologisk spørgsmål, hvor flere lægemidler skal testes med en transkriptomisk aflæsning, hvilket giver et transkriptom-bredt overblik over behandlingens cellulære virkning.

Protocol

Denne protokol følger retningslinjerne fra de lokale etiske udvalg ved universitetet i Bonn.

1. Fremstilling af buffere, opløsninger og udstyr

1. Forbered løsningerne og saml de materialer, der er beskrevet i materialetabellen.
2. Vandbadet opvarmes til 37 °C og hele vækstmediet opvarmes (RPMI-1640 + 10% føtalt kalveserum (FCS) + 1% penicillin/streptomycin).
3. Til cellehøstning skal du bruge iskold fosfatbufret saltvand (PBS).
   BEMÆRK: Hold et rent miljø, mens du arbejder med celler for at opretholde sterilitet.

2. Cellehåndtering

BEMÆRK: En detaljeret protokol for kryopræservering af mononukleære celler i perifert blod (PBMC) fra humant blod findes i⁷.

1. Optøning og tælling af celler
   1. Kryoialerne fjernes fra flydende nitrogen og tøs dem op i vandbad ved 37 °C i 2-3 minutter, mens de forsigtigt vendes på hovedet.
   2. Overfør de optøede celler til et 50 ml konisk rør.
   3. Kryoialrøret skylles med 1 ml varmt, komplet vækstmedium, og denne opløsning tilsættes dråbevis til cellerne i glasset (1^. fortyndingstrin).
   4. Fortyndingen gentages 1:1, indtil den når et volumen på 32 ml (5 fortyndinger i alt med henholdsvis 1, 2, 4, 8 og 16 ml varmt komplet vækstmedium). Tilsæt mediet dråbevis for at reducere celleforstyrrelser, mens det koniske rør omrøres lidt.
   5. Cellesuspensionen centrifugeres i 5 minutter (300 x g, 20 °C), og supernatanten fjernes ved forsigtigt at vippe det koniske rør i én flydende bevægelse.
   6. Resuspender cellerne i 3 ml varmt komplet vækstmedium og fortsæt med celletælling.
   7. Til tælling blandes 10 μL cellesuspension med trypanblå (1:2 til 1:10 fortynding afhængigt af massefylden af cellesuspensionen) for at skelne levende fra døde celler under tælling. Døde eller beskadigede celler vises blå på grund af optagelsen af farvestoffet, mens vitale celler ikke farves.
      BEMÆRK: Trypan Blue er let cytotoksisk, farvede celler bør ikke opbevares i mere end 5 min.
   8. Cellerne tælles enten med en automatiseret celletæller eller et tællekammer ved hjælp af 10 μL farvet celleopløsning.
      1. Når du bruger det Neubauer-forbedrede cellekammer, skal du tælle alle celler inden for de fire store firkanter, der er placeret i hjørnerne, og bruge følgende ligning til at beregne koncentrationen af cellesuspensionen.
         
   9. Cellerne fortyndes til en slutkoncentration på 1 x 10⁶ celler/ml med varmt komplet vækstmedium. Centrifuger kun, hvis det krævede volumen er lavere end 3 ml, og resuspender cellepillen til det rigtige volumen.
2. Cellesåning og behandling
   1. Frø 100 μL cellesuspension pr. Brønd i en 96-brønds cellekulturplade (1 x 10⁵ celler / brønd).
      BEMÆRK: Cellenummeret til såning blev optimeret til PBMC-kulturer. Mens lave cellekoncentrationer ikke giver en tilstrækkelig mængde RNA til sekventering, vil et for stort antal celler øge risikoen for suboptimal cellelyse og hæmning af den omvendte transkriptionsreaktion.
   2. Forbered lægemiddelfortyndinger i en koncentration, der er to gange den, der anvendes til behandling (2x). Vælg opløsningsmidlet i henhold til forbindelsens opløselighed, helst komplet vækstmedium.
      BEMÆRK: PBS eller dimethylsulfoxid (DMSO) kan anvendes, hvis der ikke kan opnås tilstrækkelig opløselighed på anden måde. Den maksimale koncentration af DMSO i det resulterende inkubationsvolumen bør ikke overstige 0,5 % for at forhindre cytotoksicitet induceret af opløsningsmidlet.
   3. Der tilsættes 100 μL af 2x lægemiddelfortyndingen (slutkoncentration i hul 1X) og inkuberes ved 37 °C i det definerede tidsrum.
      BEMÆRK: Supplerende undersøgelser bør udføres for at fastslå den optimale lægemiddelinkubationstid og udelukke potentielle cytotoksicitetsmekanismer.
3. Cellehøst og lysering
   1. Centrifuger cellekulturpladen i 10 minutter (300 x g, 20 °C). Supernatanten fjernes forsigtigt med en vakuumpumpe, der holder pladen i en vinkel (30°-45°), mens spidsen rettes mod brøndens lave hjørne for at fjerne så få celler som muligt.
   2. Cellerne vaskes ved at tilsætte 200 μL iskold PBS til hvert hul og centrifugere pladen i 5 minutter (300 x g, 4 °C). Supernatanten fjernes igen med en vakuumpumpe, idet pladen holdes i en skarp vinkel for at fjerne så meget PBS som muligt.
   3. Forbered lysisbufferen som beskrevet i tabel 1 for det nødvendige antal reaktioner (rxn), og tilføj 10% overdosering.
   4. Der tilsættes 15 μL lysisbuffer til hvert hul, og pladen forsegles med klæbende forseglingsfilm for at beskytte prøverne mod kontaminering. Vortex pladen før centrifugering i 1 min (1000 x g, 4 °C) og inkuber i 5 min på is.
   5. 6 μL lyseret celleopløsning opsamles i en PCR-plade og fryses kortvarigt cellelysatet ved -80 °C for at sikre optimal cellelyse. Sørg for at undgå flere frysecyklusser af pladerne.
      BEMÆRK: STOPPUNKT: Hvis cDNA-produktion ikke udføres efterfølgende, kan cellelysatet opbevares ved -80 °C i op til flere måneder uden væsentligt fald i RNA-kvaliteten.

3. Biblioteksforberedelse til sekventering

1. Revers transkriptase (RT) reaktion
   BEMÆRK: Når du arbejder med RNA, skal du placere alle prøver på is og sørge for at bruge nukleasefrit udstyr (sterilt, engangsplast) og vand.
   1. Forbered RT-reaktionsblandingen som beskrevet i tabel 2 for antallet af nødvendige reaktioner, og tilføj 10% overdosering. Kort hvirvel blandingen og kort spinde den ned. Opbevar blandingen på is indtil brug.
   2. Optø cellelysatet ved stuetemperatur (RT) og drej det kort ned for at samle alt cellelysat i bunden af pladen.
   3. Udfør mRNA-denaturering på en termocyklist i henhold til tabel 3.
   4. Tag pladen ud af termocyklisten, og drej den kort ned for at opsamle potentielt kondensat. Der tilsættes 6 μL RT-reaktionsblanding i hvert hul for et slutvolumen på 12 μL. Pladen forsegles for at beskytte pladen og for at undgå fordampning, hvirvel og centrifugering nedad.
   5. Placer pladen på termocyklisten, og start RT-reaktionsprogrammet i henhold til tabel 3.
2. Forforstærkning
   1. Optø high-fidelity DNA-polymerasen og in-situ PCR (ISPCR) primeren ved stuetemperatur.
   2. Forbered præ-amplifikationsblandingen i henhold til tabel 4 for antallet af nødvendige reaktioner, og tilføj 10% overdosering. Kort hvirvel blandingen og drej den ned.
      BEMÆRK: Enzymblandingen er stabil ved stuetemperatur i timevis.
   3. Drej PCR-pladen ned, tilsæt 15 μL af forforstærkningsblandingen til hvert hul, og forsegl pladen.
   4. Placer den på termocyklisten, og start forforstærkningsreaktionen i henhold til tabel 5.
      1. Juster antallet af cyklusser på grund af RNA-indhold. Start med et lavere tal og øg, hvis cDNA-udbyttet ikke er tilstrækkeligt.
         BEMÆRK: Efter vores erfaring bør der etableres et optimalt antal cyklusser for hver celletype, eksperimentel tilstand og behandling vil ikke påvirke det optimale antal cyklusser. Vi anbefaler derfor at etablere det optimale antal cyklusser eksperimentelt, når du opretter denne protokol for en ny celletype. Generelt vil primære celler kræve et højere antal cyklusser sammenlignet med cellelinjer. STOPPUNKT: Forforstærkningsproduktet kan opbevares ved - 20 °C.
3. cDNA-oprydning og kvalitetskontrol (QC)
   BEMÆRK: Prøveoprydning kan udføres sekventielt for hver plade, da prøverne er ret stabile på dette stadium. Forøgelse af antallet af prøver vil føre til en længere varighed af protokollen, men vil ikke begrænse antallet af prøver, der kan behandles samtidigt.
   1. Før du starter, skal du bringe de magnetiske rensningsperler til stuetemperatur og hvirvel ved høj hastighed i 1 min for at resuspendere perlerne helt.
   2. Tilsæt 0,8x v/v (20 μL) magnetiske rensningsperler til hvert hul og inkuber ved stuetemperatur i 5 min.
   3. Placer PCR-pladen på et magnetstativ i 5 minutter, indtil perlerne er helt adskilt. Supernatanten fjernes forsigtigt.
   4. Hold pladen på magnetristen, tilsæt forsigtigt 100 μL frisklavet 80% ethanol for at vaske perlerne og inkubere i 30 s. Brug en pipette med lille volumen til at fjerne supernatanten. Gentag for et ekstra vasketrin. Sørg for at fjerne så meget ethanol som muligt.
   5. Lufttør perlerne på magnetstativet ved stuetemperatur i op til 5 min, indtil ethanolen er helt fordampet, og perlerne ikke længere ser skinnende ud.
   6. Fjern pladen fra magnetstativet, resuspender perlerne i 20 μL nukleasefrit vand og inkuber i 2 min.
   7. Placer pladen igen på magnetstativet, indtil perlerne er adskilt.
   8. Genvind eluatet i en ny PCR-plade til cDNA QC og tagmentation.
   9. Udfør et TapeStation- eller FragmentAnalyzer-assay for at evaluere størrelsesfordelingen og koncentrationen af cDNA-biblioteket (anbefales: TapeStation D5000-assay). Du kan finde flere oplysninger i producentens instruktioner. Et typisk udbytte på 20 ng kan forventes.
4. Mærkning med kit
   BEMÆRK: Andre tagmentationsprotokoller kan bruges, hvis de allerede er etableret.
   1. cDNA'et fortyndes til en slutkoncentration på 150 - 300 pg/μL med nukleasefrit vand.
   2. Forprogrammere termocyklisten i henhold til tabel 6 for at sikre en øjeblikkelig start af tagmentationsreaktionen efter tilsætning af cDNA til enzymblandingen.
   3. Forbered tagmentationsblandingen i henhold til tabel 7 for antallet af nødvendige reaktioner, og tilføj 10% overforbrug.
   4. Fordel 3 μL af tagmentationsblandingen pr. reaktion på en ny PCR-plade, og tilsæt 1 μL cDNA til hver reaktion.
   5. Start tagmentationsreaktionen umiddelbart efter tilsætning af cDNA'et.
   6. Inaktiver reaktionen ved at tilsætte 1 μL neutraliseret tagmentbuffer (NT; alternativt kan 0,2% natriumdodecylsulfat (SDS) anvendes).
5. Berigelse PCR
   1. Forbered berigelses-PCR-blandingen tabel 7 for antallet af reaktioner, og tilføj 10% overdosering. (Anbefalet: Nextera UDI indstillet til at forhindre indekshopping på mønstrede flowceller (f.eks. Illumina NovaSeq 6000)).
   2. Der tilsættes 9 μL af berigelses-PCR-blandingen til hver reaktion for et samlet volumen på 14 μL.
   3. Kør berigelses-PCR-programmet i henhold til tabel 8.
      BEMÆRK: For berigelses-PCR er 16 cyklusser standard. Hvis cDNA-kvaliteten er dårlig, kan der tilføjes yderligere cyklusser.
6. Oprydning og QC
   1. Før du starter, skal du bringe magnetiske rensningsperler til stuetemperatur og hvirvel ved høj hastighed i 1 min for at resuspendere perlerne helt.
   2. Tilsæt 1,0x v/v (14 μL) magnetiske oprensningsperler og inkuber ved stuetemperatur i 5 min.
   3. Placer pladen på et magnetstativ og vent i 5 minutter, indtil perlerne er helt adskilt. Supernatanten fjernes forsigtigt.
   4. Hold pladen på magnetristen, tilsæt forsigtigt 100 μL frisklavet 80% ethanol for at vaske perlerne og inkubere i 30 s. Brug en pipette med lille volumen til at fjerne supernatanten. Gentag for et ekstra vasketrin. Sørg for at fjerne så meget ethanol som muligt.
   5. Lufttør perlerne ved stuetemperatur i 3 min, eller indtil de ikke længere ser skinnende ud.
   6. Fjern pladen fra magnetstativet, resuspender perlerne i 20 μL nukleasefrit vand og inkuber i 2 min.
   7. Placer pladen igen på magnetstativet, indtil perlerne adskilles, og genvind eluatet i en ny PCR-plade til bibliotekets QC.
   8. Udfør et TapeStation- eller fragmentanalysatorassay for at evaluere størrelsesfordelingen og koncentrationen af cDNA-biblioteket (anbefales: TapeStation D1000-analyse med høj følsomhed). Du kan finde flere oplysninger i producentens instruktioner. I gennemsnit kan der forventes et udbytte på 10 NG.
      BEMÆRK: STOPPUNKT: PCR-produktet kan opbevares ved - 20 °C.

4. Sekvensering og forbehandling af data

1. Sekventering
   BEMÆRK: Følgende retningslinje vil være gældende for alle Illumina-instrumenter til kortlæst sekventering. Hvis instrumenteringen ikke er tilgængelig, kan sekventeringen udføres af en ekstern sekventeringsfacilitet. Andre sekventeringsmetoder kan også anvendes. For nemheds skyld valgte vi kun at rapportere om den mest anvendte sekventeringsteknologi.
   BEMÆRK: Følgende trin relateret til softwarebrug beskriver proceduren på en Illumina NovaSeq6000 sequencer.
   1. Pulje entydigt indekserede biblioteker i et ækvimolært forhold i henhold til resultaterne opnået i trin 3.6.8.
   2. Koncentrationen af den endelige pool måles med et højsensitivt assay til beregning af prøvemolariteten på følgende måde:
      
   3. Ilæg flowcellen i henhold til instrumentets specifikation og til eksperimentel optimering. Eksempler på belastningskoncentrationer af fælles instrumenter er vist i tabel 9.
   4. Ved at trykke på skærmen skal du vælge Sekvens for at starte kørselsopsætningen.
   5. Følg instruktionerne på skærmen og ilægningsflowcellen, sekvens-for-syntese-patronen, klyngepatronen, bufferpatronen, og sørg for, at affaldsbeholderne er tomme.
   6. Når alle reagenser er blevet genkendt af instrumentet, skal du klikke på Kør opsætning. Definer her kørselsnavnet og outputmappen for at gemme dataene.
   7. Definer sekventeringsdetaljerne som parret ende med begge læsninger på 51 bp. To indekslæsninger sekventeres også med 8 bp hver.
   8. Tryk på Gennemse , og tryk på Start Kør, når du har kontrolleret, om alle sekventeringsoplysninger er korrekte.
      BEMÆRK: Den anbefalede sekventeringsdybde er 5 x 10⁶ læsninger/prøver, med mindst 1 x 10⁶ læsninger/prøver.
2. Forbehandling af data
   1. Transformér rå sekventeringsdata til FASTQ-format, og demultiplex i henhold til eksempelindekserne med værktøjet Bcl2Fastq2. Udfør demultiplexing med standardindstillinger. For detaljerede instruktioner om Bcl2Fastq2, se referencemanualen.
      BEMÆRK: FASTQ-konvertering og demultiplexing udføres normalt af sekventeringsfaciliteten, hvis sekventering ikke udføres internt. Sekventeringsfaciliteter vil normalt give demultiplexed FASTQ til videre behandling.
   2. Flere muligheder er tilgængelige for datajustering og kvantificering af overflod af sekventeringslæsninger (anbefalet: nf-core RNA-seq-pipeline (https://nf-co.re/rnaseq)). Rørledningen giver flere muligheder, brug standardindstillingen med STAR⁸ som justeret og Salmon⁹ til at kvantificere transkriptionsmængden.
   3. BEMÆRK: For yderligere bioinformatikanalyse er flere metoder tilgængelige. Det ligger ikke inden for denne protokols anvendelsesområde at dække alle (Anbefalet: DEseq2 pipeline¹⁰). Et standardscript baseret på DEseq2-arbejdsgangen udviklet af os kan findes på GitHub (https://github.com/jsschrepping/RNA-DESeq2).

Representative Results

Efter den rapporterede protokol blev humane PBMC'er podet, behandlet med forskellige immunmodulerende lægemidler og efter forskellige inkubationstider høstet til bulktranskriptomisk analyse ved hjælp af sekventeringsprotokollen (figur 1).

Ideelle lægemiddelkoncentrationer og inkubationstider for testforbindelser bør identificeres opstrøms denne protokol ved hjælp af komplementære eksperimentelle strategier og baseret på det specifikke videnskabelige spørgsmål. I de fleste tilfælde bør 2 - 4 timer og 24 timers inkubation give en repræsentation af tidlige og sene transkriptionelle reaktioner på behandlingen.

De vigtigste resultater til evaluering af de korrekte udførelser af protokollen er cDNA og bibliotek QC'er (figur 2 og figur 3). cDNA-profil skal have en bred fordeling med en gennemsnitlig størrelse på > 1000 bp (figur 2), en lavere gennemsnitlig størrelse eller akkumulering af molekyler ved lav molekylvægt (figur 4) kan indikere et lavt RNA-input eller RNA-nedbrydning.

Forberedelsen af et godt sekventeringsbibliotek er også et vigtigt skridt i protokollen; post-tagmentation biblioteker bør have en ret snæver fordeling på omkring 250 bp (figur 3); længere fragmenter vil fungere dårligt under sekventering (figur 5).

Efter sekventering justeres rå FASTQ-filer mod det relevante referencegenom (f.eks. Menneske eller mus), og transkriptionsmængden kvantificeres for hver prøve (se nf-core RNA-seq-pipeline (https://nf-co.re/rnaseq)). Der vil nu blive udført sonderende dataanalyse for at kontrollere den overordnede kvalitet af dataene. Justerede data skal fange et stort antal proteinkodende gener, da kun polyadenyleret RNA vil blive fanget med denne protokol (figur 6A). I humane prøver forventer vi at fange mellem 15000 og 20000 transkripter (denne værdi er baseret på GENCODE 27 reference human genome annotation¹¹). Yderligere sonderende dataanalyse kan omfatte analyse af hovedkomponenter (PCA). Her kan den underliggende struktur af dataene visualiseres i et todimensionelt plot. I figur 6B viser vi et eksemplarisk PCA-plot; Prikker her er farvet ved behandling, der viser tre forskellige klynger af eksperimentelle tilstande, der fører til lignende transkriptomiske profiler. Det kan også ses her, at biologiske replikater (prikker med samme farve) er transkriptionelt ens, hvilket viser en god robusthed af protokollen. Resultaterne vist i denne figur blev genereret med pipeline tilgængelig på GitHub baseret på DESeq2-arbejdsprocessen (https://github.com/jsschrepping/RNA-DESeq2).

Figur 1: Tidsestimater og arbejdsgang. (A) Tidsestimater af denne protokol for en kørsel med 96 prøver. (B) Diagram over hvert trin i protokollen fra optøning af cellerne til forbehandling af data. Diagrammet skal læses fra top til bund efter pilene. Cirklede pile beskriver en gentagelse af trinnet. Røde prikker repræsenterer stoppunkter, der er yderligere beskrevet i protokollen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Eksemplariske resultater for cDNA-biblioteker. Resultater af en miniaturiseret elektroforese, der viser størrelsesfordelingen af eksemplarisk cDNA-bibliotek. Øvre og nedre signaler repræsenterer markører, der bruges til at justere prøven. Blå linjer angiver de gennemsnitlige fragmentstørrelser (blå parenteser). cDNA-profilen viser en bred fordeling med en gennemsnitlig størrelse på > 1000 bp. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Eksemplariske resultater for sekventeringsbiblioteker. Resultater af en miniaturiseret elektroforese, der viser størrelsesfordelingen af vellykkede forberedte sekventeringsbiblioteker med en smal fordeling og en gennemsnitlig størrelse på omkring 250 bp. Øvre og nedre signaler repræsenterer markører, der bruges til at justere prøven. Blå linjer angiver de gennemsnitlige fragmentstørrelser (blå parenteser). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Eksemplariske suboptimale resultater for cDNA-biblioteker. Resultater af en miniaturiseret elektroforese, der viser størrelsesfordelingen af et suboptimalt cDNA-bibliotek med en gennemsnitlig størrelse på < 200 bp. Øvre og nedre signaler repræsenterer markører, der bruges til at justere prøven. Blå linjer angiver de gennemsnitlige fragmentstørrelser (blå parenteser). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Eksemplariske suboptimale resultater for sekventeringsbiblioteker. Resultater af en miniaturiseret elektroforese, der viser størrelsesfordelingen af et suboptimalt sekventeringsbibliotek indeholdende længere fragmenter på 200 - 1000 bp. Øvre og nedre signaler repræsenterer markører, der bruges til at justere prøven. Blå linjer angiver de gennemsnitlige fragmentstørrelser (blå parenteser). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: Sonderende dataanalyse. Repræsentative resultater af sonderende dataanalyse, der viser virkningen af udvalgte immunmodulerende lægemidler på PBMC'er. (A) Søjlediagram over antallet af detekterede gener (Y-akser) adskilt efter gentype (X-akser). (B) PCA af alle gener i datasættet farvet af de forskellige lægemiddelbehandlinger. Prikker med samme farve er biologiske replikater. Klik her for at se en større version af denne figur.

Reagens	Koncentration	Volumen [μL] /rxn
Guanidinhydrochlorid	80 mM	7.50
Deoxynukleotidtrifosfater (dNTP'er)	10 mM hver	6.52
SMART dT30VN primer	100 μM	0.33
Nukleasefrit vand		0.65
Samlet volumen		15.00

Tabel 1: Lysisbuffer.

Reagens	Volumen [μL] /rxn
SSRT II-buffer (5x)	2.00
DTT (100 mM)	0.50
Betain (5 m)	2.00
MgCl2 (1 m)	0.14
SSRT II (200 U/μL)	0.25
RNAse-hæmmer (40 E/μL)	0.25
TSO-LNA (100 μM)	0.20
Nukleasefrit vand	0.66
Samlet volumen	6.00

Tabel 2: Omvendt transkriptase (RT) reaktionsblanding.

mRNA denaturering
Skridt	Temperatur	Varighed
mRNA denaturering	95 °C	2 minutter
	på is	2 minutter
Omvendt transkription
Skridt	Temperatur	Varighed
Omvendt transkription	42 °C	90 minutter
Inaktivering af enzymer	70 °C	15 minutter
	4 °C	holde

Tabel 3: Termocyklisk program til mRNA-denaturering og revers transkriptase (RT).

Reagens	Volumen [μL] /rxn
Hi-fi-DNA-polymerase	12.50
ISPCR-primer (10 μM)	0.15
Nukleasefrit vand	2.35
Samlet volumen	15.00

Tabel 4: Forforstærkningsmix.

Trin	Temperatur	Varighed
Indledende denaturering	98 °C	3 minutter
Denaturering	98 °C	20 sek.	16 – 18 cyklusser
Udglødning	67 °C	20 sek.
Forlængelse	72 °C	6 minutter
	4 °C	holde

Tabel 5: Forforstærkning termocyklisk program.

Trin	Temperatur	Varighed
Mærkning	55 °C	8 minutter
	4 °C	holde

Tabel 6: Mærkning termocyklist program.

Tagmentation mix
Reagens	Volumen [μL] /rxn
Amplicon Tagment Mix (ATM)	1.0
Tagment DNA-buffer (TD)	2.0
Samlet volumen	3.0
Berigelse PCR mix
Reagens	Volumen [μL] /rxn
Hi-fi-DNA-polymerase	7.0
Nextera-kompatibel indekseringsprimer	2.0
Samlet volumen	9.0

Tabel 7: Mærkningsmix og berigelses-PCR-mix.

Trin	Temperatur	Varighed
Varm start	72 °C	5 minutter
Indledende denaturering	98 °C	30 s
Denaturering	98 °C	10 sek	16 cyklusser
Udglødning	60 °C	30 s
Forlængelse	72 °C	1 min
Endelig forlængelse	72 °C	5 minutter
	4 °C	holde

Tabel 8: Berigelse PCR termocyklist program.

Instrument	Indlæsning koncentration
MiSeq v2	10 pM
NæsteSeq 500/550	1,4 pM
NovaSeq 6000	1250 pM

Tabel 9: Eksempler på belastningskoncentrationer af almindelige sekventeringsinstrumenter.

Discussion

Lægemiddelopdagelse og lægemiddeludvikling kan i høj grad drage fordel af det holistiske syn på cellulære processer, som bulktranskriptomik kan give. Ikke desto mindre er denne tilgang ofte begrænset af de høje omkostninger ved eksperimentet med standard bulk RNA-seq-protokol, der forbyder dets anvendelse i akademiske omgivelser såvel som dets potentiale for industriel skalerbarhed.

De mest kritiske trin i protokollen er celleoptøning og de indledende trin i biblioteksforberedelsen. Sikring af cellernes høje levedygtighed efter optøning er afgørende for vellykkede behandlinger og transkriptomisk analyse. De første trin i cellehøstning og biblioteksforberedelse indtil cDNA-syntese er afgørende for at bevare RNA'ets integritet. Det er afgørende på dette stadium at holde cellelysatet på is hele tiden og behandle prøverne så hurtigt som muligt. Hvis der observeres overdreven RNA-nedbrydning, skal laboratorieoverflader og udstyr rengøres med specifikke produkter for at hæmme enhver RNase-aktivitet.

Protokollen beskrevet her er i øjeblikket optimeret til lægemiddelbehandling på PBMC'er fra raske donorer i maksimalt 24 timer. For at udføre eksperimentet med en anden celletype eller i længere inkubationstid skal cellenumre til såning og dyrkningsbetingelser muligvis optimeres i overensstemmelse hermed.

Med denne protokol leverer vi en arbejdsgang til transkriptomisk analyse ved lægemiddelbehandling på PBMC'er ved hjælp af standard laboratorieudstyr og intet behov for kommercielle kits. Med denne tilgang og undgå trinnet med RNA-oprensning reducerede vi omkostningerne betydeligt, hvilket muliggjorde parallel analyse af et stort antal forbindelser.

Fordi denne protokol er baseret på et in vitro-assay, er dens største begrænsning, at den ikke kan evaluere nogen metabolisk behandling af lægemidlerne, der kan føre til forskellig bioaktivitet. Derudover vil antallet af fangede transkripter og sekventeringsdybde være lavere end i standard bulk transkriptomiske metoder i fuld længde, hvilket forhindrer brugen af disse data til applikationer, der kræver højere informationsindhold, såsom differentiel splejsning eller kvantificering af enkeltnukleotidpolymorfier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL conical tube	fisher scientific	10203001
Adhesive PCR Plate Seals	Thermo Fisher Scientific	AB0558
Amplicon Tagment Mix (ATM)	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples)
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A 63881
Betaine	Sigma-Aldrich	61962
Cell culture grade 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	260860
Cell culture vacuum pump (VACUSAFE)	Integra Bioscience	158300
Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each	Fermentas	R0192
DMSO	Sigma-Aldrich	276855
DTT (100 mM)	Invitrogen	18064-014
EDTA	Sigma-Aldrich	798681	for adherent cells
Ethanol	Sigma-Aldrich	51976
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	26140079
Filter tips (10 µL)	Gilson	F171203
Filter tips (100 µL)	Gilson	F171403
Filter tips (20 µL)	Gilson	F171303
Filter tips (200 µL)	Gilson	F171503
Guanidine Hydrochloride	Sigma-Aldrich	G3272
ISPCR primer (10 µM)	Biomers.net GmbH	SP10006	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)	KAPA Biosystems	KK2601
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Magnetic stand 96	Ambion	AM10027
Neutralize Tagment (NT) Buffer	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS
Nextera-compatible indexing primer	Illumina
Nuclease-free water	Invitrogen	10977049
PBS	Thermo Fisher Scientific	AM9624
PCR 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	AB0600
PCR plate sealer	Thermo Fisher Scientific	HSF0031
Penicillin / Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15070063
Qubit 4 fluorometer	Invitrogen	15723679
Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul)	TAKARA	2313A
RPMI-1640 cell culture medium	Gibco	61870036	If not working with PBMCs, adjust to cell type
SMART dT30VN primer	Sigma-Aldrich		5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3
Standard lab equipment	various	various	e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II)	Thermo Fisher Scientific	18064-014
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x)	Thermo Fisher Scientific	18064-014
Tagment DNA Buffer (TD)	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples)
TapeStation system 4200	Agilent	G2991BA
Thermocycler (S1000)	Bio-Rad	1852148
TSO-LNA (100 uM)	Eurogentec		5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G
Vortex-Genie 2 Mixer	Sigma-Aldrich	Z258415