استئصال أكسوتوم ليزر فوتونين: طريقة لإصابة أكسون في أجنة حمار وحشي ومراقبة التعافي المحوري

Overview

يصف هذا الفيديو طريقة إصابة المحاور في أجنة حمار وحشي باستخدام اثنين من استئصال الاكستوغر بالليزر الفوتون ومراقبة التعافي المحوري من الإصابة.

Protocol

1: اثنين من الفوتون axotomy باستخدام المجهر بنيت مخصصة اثنين الفوتون مع ليزر الحرباء تي الياقوت

1. الاستعداد للتصوير. ضع الجنين المركب (الأجنة) على حامل الشريحة تحت المجهر. التركيز على جنين واحد مع 40X (0.8 NA) هدف المياه. قم بتشغيل الليزر. لقد تمكنا من تصور وتلف بشكل مستنسخ GFP التعبير عن الخلايا العصبية باستخدام المعلمات التالية. لتصور المحاور في قوة غير ضارة، تعيين الليزر إلى الطول الموجي من 910 نانومتر (نانومتر) وقوة 30 ملليواط (mW المدرجة هي كمية الطاقة في العينة). افتح برنامج التصوير. نحن نستخدم برنامج ScanImage الذي تم تطويره في مختبر كاريل سفوبودا.
2. اضغط على التركيز لمسح الجنين بالليزر ثنائي الفوتون، وحدد المحور الذي ترغب في أكستوميز، والتقاط صورة لهذا المحور. وضع علامة على المواضع Z الأول والأخير، والحصول على الصورة، وجعل الإسقاط الأقصى من مداخن Z.
3. تكبير 70X على فرع المحور الذي ترغب في axotomize والتوقف عن المسح الضوئي. قم بزيادة كمية ال mW في العينة إلى الطاقة الضارة التي تبلغ 180 كيلوواط، وا أجروا مسحا ضوئيا واحدا باستخدام الليزر. نقوم بذلك عن طريق تعيين عدد شرائح Z إلى 1 والضغط على "Grab". يجب أن يكون هذا كافيا لقطع المحور. راجع مناقشة طرق تحسين هذا الإجراء للمجهر والهدف التجريبي.
4. قم بالتصغير، وقلل الطاقة إلى 30 كيلوواط، واخرج صورة.

2: اثنين من الفوتون axotomy على زايس 510 confocal / اثنين من الفوتون المجهر

1. ضع جنينا مثبتا على المسرح وركز عليه باستخدام هدف الماء 25X أو أي هدف مناسب آخر.
2. قم بتشغيل ليزر الفوتونين (910 نانومتر) والأرجون (488 نانومتر) في إعداد متعدد المسارات بحيث يمكن التبديل من واحد إلى آخر. على الرغم من أن كلا الليزرين يستخدمان للكشف عن GFP ، إلا أن انبعاث الفوتونين يتم تصوره باللون الأحمر ، وانبعاث ليزر الأرجون باللون الأخضر للتمييز بين الاثنين.
3. استخدم ليزر الأرجون لتحديد محور للإصابة. تحت إعدادات Z وضع علامة على المقاطع البصرية الأولى والأخيرة. التقاط صورة confocal وإنشاء الإسقاط الأقصى للكدسة Z.
4. اختر منطقة المحور للإصابة واجلب هذه المنطقة إلى بؤرة التركيز. قم بإيقاف تشغيل ليزر Argon ثم قم بتشغيل ليزر فوتونين. مسح العينة مع اثنين من فوتون في كثافة الليزر من ~ 9٪ انتقال للتأكد من أن المحور لا يزال في التركيز.
5. انقر على زر "إيقاف" بحيث تكون أداة الاقتصاص متاحة. استخدام المحاصيل للتكبير على منطقة الاهتمام. عادة ما نقوم بالتكبير إلى ~ 70X (يمكن التحقق من التكبير تحت علامة التبويب "الوضع"). تحت علامة التبويب "قنوات" تغيير كثافة الفوتون اثنين من ~ 9٪ الإرسال إلى 15-20٪ الإرسال.
6. لقطع المحور تنشيط زر "XY سريع" لمدة 1 ثانية ثم اضغط على زر التوقف لتجنب الضرر الزائد. وينبغي النظر إلى المحور على أنه حطام متناثر إذا نجح الإجراء.
7. للتأكد من أن المحور قد تضرر التبديل مرة أخرى إلى ليزر أرغون 488 نانومتر، واتخاذ صورة confocal آخر، وخلق الإسقاط الأقصى.