Overview
このビデオでは、2つの光子レーザー奇方評価を使用してゼブラフィッシュ胚の軸索を傷つける方法と、損傷からの軸索回復を観察する方法について説明します。
Protocol
1:カメレオンTi-サファイアレーザーを用いたカスタム構築2光子顕微鏡を用いた2光子奇像
- イメージングの準備をします。取り付けた胚を顕微鏡の下のスライドホルダーに置きます。40X(0.8 NA)の水目的を持つ1つの胚に焦点を当てます。レーザーの電源を入れます。以下のパラメータを用いて、GFP発現ニューロンを再現的に可視化し、損傷を与えることができました。非損傷電力で軸索を視覚化するには、レーザーを910ナノメートル(nm)の波長に設定し、30ミリワットの電力(mWはサンプルの電力量を示す)に設定します。イメージングソフトウェアを開きます。私たちは、カレルスボボダの研究室で開発されたScanImageソフトウェアを使用しています。
- フォーカスを押して2光子レーザーで胚をスキャンし、アソクショトマイズしたい軸索を見つけ、この軸索の画像をキャプチャします。最初と最後の Z 位置をマークし、イメージを取得し、Z スタックの最大投影を行います。
- あなたがアキソトマイズし、スキャンを停止したい軸索の枝に70倍ズーム。サンプルのmWを180mWのダメージパワーまで上げ、レーザーで1回スキャンします。これを行うには、Zスライスの数を1に設定し、「グラブ」を押します。これは軸索を切断するのに十分なはずです。顕微鏡と実験目標のためにこの手順を最適化する方法については、議論をご覧ください。
- ズームアウトし、30 mWに電力を減らし、画像を撮ります。
2:ツァイス510共焦点/2光子顕微鏡の2光子奇像
- 取り付けられた胚をステージに置き、25倍の水目的または他の適切な目的を使用して焦点を合わせます。
- 2光子(910 nm)とアルゴン(488 nm)のレーザーをマルチトラック設定でオンにして、1つから他方に切り替えることができます。両方のレーザーを使用してGFPを検出しますが、2光子の放出は赤で視覚化され、アルゴンレーザー放射は緑色で視覚化され、両者を区別します。
- アルゴンレーザーを使用して、傷をつける軸索を特定します。[Z]設定で、最初と最後の光学セクションをマークします。共焦点イメージを取り、Z スタックの最大投影を作成します。
- 負傷する軸索の領域を選択し、この領域に焦点を当てます。アルゴンレーザーをオフにし、2光子レーザーをオンにします。2光子で、2光子で、~9%の透過率で試料をスキャンし、軸索がピントが引き続きピントに合っていることを確認します。
- トリミングツールを使用できるように、「停止」ボタンをクリックします。トリミングを使用して、対象領域を拡大表示します。通常、我々は〜70Xにズーム(「モード」タブでズームをチェックすることができます)。「チャンネル」タブで、2光子の強度を~9%の伝送から15~20%の伝送に変更します。
- 軸索を切断するには、約1秒間「高速XY」ボタンをアクティブにし、余分な損傷を避けるために停止ボタンを押します。手順が機能した場合、軸索は散乱した破片と見なされるべきです。
- 軸索が破損していることを確認するために、488 nmアルゴンレーザーに戻ってスイッチを取り戻し、別の共焦点イメージを取り、最大の投影を作成します。
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