To-foton laser axotomy: en metode for å skade axoner i sebrafisk embryoer og observere axonal utvinning

Overview

Denne videoen beskriver metoden for å skade aksoner i sebrafiskembryoer ved hjelp av to fotonlaseraxotomi og observere axonal utvinning fra skade.

Protocol

1: To-foton axotomy ved hjelp av en spesialbygd to-foton mikroskop med en Chameleon Ti-Sapphire laser

1. Forbered deg på avbildning. Plasser de monterte embryoene på en skyveholder under mikroskopet. Fokuser på ett embryo med et vannmål på 40X (0,8 NA). Slå på laseren. Vi har vært i stand til å reprodusere visualisere og skade GFP som uttrykker nevroner ved hjelp av følgende parametere. For å visualisere axoner med en ikke-skadelig effekt, sett laseren til en bølgelengde på 910 nanometer (nm) og en effekt på 30 milliwatt (mW oppført er mengden strøm ved prøven). Åpne bildebehandlingsprogramvaren. Vi bruker ScanImage Software utviklet i Karel Svobodas laboratorium.
2. Trykk fokus for å skanne embryoet med to-foton laser, finne axon du ønsker å axotomisere, og fange et bilde av denne axon. Merk den første og siste Z-posisjonen, skaff deg bildet og lag en maksimal projeksjon av Z-stakkene.
3. Zoom inn 70X på grenen av axonen du ønsker å axotomisere og stoppe skanningen. Øk mW ved prøven til den skadelige effekten på 180 mW, og utfør en enkelt skanning med laseren. Vi gjør dette ved å sette antall Z-skiver til 1 og trykke på "Grab". Dette bør være tilstrekkelig til å kutte axon. Se diskusjon for metoder for å optimalisere denne prosedyren for mikroskopet og eksperimentelt mål.
4. Zoom ut, reduser strømmen til 30 mW og ta et bilde.

2: To-foton axotomy på Zeiss 510 konfokal/ to-foton mikroskop

1. Plasser montert embryo på scenen og ta det i fokus ved hjelp av et 25X vannmål eller annet passende mål.
2. Slå på to-foton (910 nm) og Argon (488 nm) lasere i en flersporsinnstilling slik at det er mulig å bytte fra den ene til den andre. Selv om begge laserne brukes til å oppdage GFP, visualiseres tofotonutslippet med rødt, og argonlaserutslippet med grønt for å skille de to.
3. Bruk Argon laser for å identifisere en axon å skade. Merk første og siste optiske seksjon under Z-innstillinger. Ta et konfokalt bilde og opprett en maksimal projeksjon av Z-stakken.
4. Velg regionen av axon som skal skades og bringe denne regionen i fokus. Slå av Argon-laseren og slå på tofotonlaseren. Skann prøven med to-foton med en laserintensitet på ~ 9% overføring for å sikre at axon fortsatt er i fokus.
5. Klikk på "stopp" -knappen slik at beskjæringsverktøyet blir tilgjengelig. Bruk beskjæring til å zoome inn på interesseområdet. Vanligvis zoomer vi til ~ 70X (zoom kan kontrolleres under "modus" -fanen). Under "kanaler" -fanen endrer intensiteten til to-foton fra ~ 9% overføring til 15-20% overføring.
6. For å kutte en axon, aktiver "rask XY" -knappen i ca. 1 sekund, og trykk deretter på stoppknappen for å unngå overflødig skade. Axonen skal ses på som spredt rusk hvis prosedyren fungerte.
7. For å sikre at axonen ble skadet, bytt tilbake til Argon-laseren på 488 nm, ta et annet konfokalt bilde og lag en maksimal projeksjon.