Overview
이 비디오는 두 개의 광자 레이저 축 절제술을 사용하여 얼룩말 물고기 배아에서 축축을 손상시키고 부상에서 축 하 회복을 관찰 하는 방법을 설명 합니다.
Protocol
1: 카멜레온 티 사파이어 레이저를 사용하여 사용자 정의 내장 된 두 광자 현미경을 사용하여 두 광자 축 절제술
- 이미징을 준비합니다. 장착된 배아를 현미경 아래 슬라이드 홀더에 놓습니다. 40배(0.8NA) 물 목표를 가진 하나의 배아에 집중하십시오. 레이저를 켭니다. 우리는 다음과 같은 매개 변수를 사용하여 뉴런을 표현하는 GFP를 재현적으로 시각화하고 손상시킬 수 있었습니다. 축축을 손상되지 않는 전력으로 시각화하려면 레이저를 910나노미터(nm)의 파장과 30밀리와트의 전력(mW 나열시)으로 설정합니다. 이미징 소프트웨어를 엽니다. 우리는 카렐 스보보다의 실험실에서 개발 된 ScanImage 소프트웨어를 사용합니다.
- 2광자 레이저로 배아를 스캔하고, 축축화하려는 축축을 찾아, 이 축축의 이미지를 캡처하는 데 초점을 누릅니다. 첫 번째 및 마지막 Z 위치를 표시하고 이미지를 획득하고 Z 스택을 최대 투영합니다.
- 축절화 및 스캔을 중지하려는 축축의 분기에 70배 확대합니다. 샘플에서 mW를 180mW의 손상 전력으로 늘리고 레이저로 단일 스캔을 수행합니다. Z 슬라이스 수를 1개로 설정하고 "Grab"을 눌러 이 작업을 수행합니다. 이것은 축축을 끊기에 충분합니다. 현미경 및 실험 목표에 대한 이 절차를 최적화하는 방법에 대한 토론을 참조하십시오.
- 전원을 30mW로 줄이고 이미지를 촬영합니다.
2: 자이스 510 공초점/2광자 현미경에 2광자 축 절제술
- 장착된 배아를 무대에 배치하고 25X 물 목표 또는 기타 적합한 목표를 사용하여 초점을 맞춥니다.
- 멀티 트랙 설정에서 2광자(910nm)와 아르곤(488nm) 레이저를 켜서 한 쪽에서 다른 레이저로 전환할 수 있습니다. 두 레이저모두 GFP를 감지하는 데 사용되지만, 2광자 방출은 빨간색으로 시각화되고, 두 레이저방출을 녹색으로 방출하여 두 레이저를 차별화합니다.
- 아르곤 레이저를 사용하여 부상을 입을 축축한 것을 식별합니다. Z 설정에서 첫 번째 및 마지막 광학 섹션을 표시합니다. 공초점 이미지를 가져 와서 Z 스택의 최대 투영을 만듭니다.
- 축축기 의 영역을 선택하여 부상을 입고이 지역을 집중시하십시오. 아르곤 레이저를 끄고 2광자 레이저를 켭니다. 2광자로 시편을 +9% 전송의 레이저 강도로 스캔하여 축축이 여전히 초점을 맞추고 있는지 확인합니다.
- 자르기 도구를 사용할 수 있도록 "중지" 버튼을 클릭합니다. 자르기를 사용하여 관심 영역을 확대합니다. 일반적으로 ~70X로 확대합니다(줌은 "모드" 탭에서 확인할 수 있습니다). "채널" 탭에서 2광자의 강도를 ~9%에서 15-20%의 전송으로 변경합니다.
- 축삭을 끊려면 약 1 초 동안 "빠른 XY"버튼을 활성화한 다음 정지 버튼을 눌러 과도한 손상을 방지합니다. 절차가 효과가 있다면 축축은 흩어진 파편으로 보아야 합니다.
- 축축이 488nm 아르곤 레이저로 다시 스위치가 손상되었는지 확인하려면 다른 공초점 이미지를 가지고 최대 프로젝션을 만듭니다.
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