التفكك الميكانيكي: طريقة للحصول على خلايا قابلة للحياة من نسيج

Overview

يصف هذا الفيديو التفكك غير الأنزيمي للأنسجة البشرية الطازجة للحصول على خلايا قابلة للحياة. يتم استخدام هذه التقنية للتحليل النوعي والكمي للخلايا الإيجابية CD45 (الخلايا الليمفاوية / الكريات البيض) الموجودة في مختلف الأنسجة البشرية الطبيعية والخبيثة.

Protocol

1. إعداد الأنسجة متجانسة

1. تشريح الأنسجة التي تم استئصالها (الأنسجة الخبيثة والعادية التي تم استئصالها من غرفة العمليات) موجودة في مختبر علم الأمراض من قبل موظفين مدربين للاستلام الفوري. الورم، NANT (تؤخذ أبعد مسافة ممكنة من الورم) وشظايا الأنسجة الطبيعية تتم معالجتها بشكل روتيني في غضون 1-3 ساعة من الختان الجراحي في مختبر BSL2 باستخدام إجراءات السلامة البيولوجية القياسية للأنسجة البشرية. يتم توضيح مخطط تدفق البروتوكول في الشكل 1.
2. وزن جميع شظايا الأنسجة (طبيعي، NANT والورم) وقياس الطول والعرض والارتفاع (طول × العرض × الارتفاع). هذه خطوة هامة للتطبيع اللاحق للخلايا الفرعية ، الحمض النووي الريبي المستخرج ، إلخ.
   ملاحظة: نطاق حجم العينة هو 100 إلى 10،000 ملم³ مع عدم وجود الدهون إذا كان ذلك ممكنا.
3. بصمة جزء الورم على شريحة زجاجية لتلطيخ H & E للتحقق من أن الأنسجة هي في الواقع جزء من الورم.
   1. قم بذلك عن طريق الضغط على شريحة مجهر زجاجي على جزء الورم وتطبيق ضغط لطيف بأصابعك لبضع ثوان.
   2. إصلاح الشريحة مع ايزوبروبانول لمدة 2 دقيقة تليها خطوة الغسيل في الماء. مضادة للأنسجة لمدة 30 ثانية مع hematoxylin ماير.
   3. غسل الشريحة في ستة حمامات من الماء. وصمة عار في Phloxine B 2٪ لمدة 15 ثانية.
   4. غسل في حمام واحد من الماء تليها أربعة حمامات من الايزوبروبانول والانتهاء مع حمام واحد من الماء.
   5. احتضان في ايزوبروبانول لمدة 1 دقيقة واستنزاف. واضحة في حمامين من الزيلين.
   6. جبل مع xylene القائم على تصاعد المتوسطة. فحص للخليوية الورم (الشكل 2).
      ملاحظة: بشكل رئيسي ، تلتصق الخلايا السرطانية بالشريحة المطبوعة - نادرا ما تبقى الخلايا النجمية أو اللمفاوية أو الدهنية ، مما يترك مساحات بين الخلايا السرطانية(الشكل 2).
4. ضع جزء الأنسجة في طبق زراعة صغير يحتوي على مل واحد من وسيط الخلية الدموية المحدد كيميائيا الخالي من المصل (يشار إليه فيما بعد باسم متوسط) في درجة حرارة الغرفة ونرده إلى قطع صغيرة (~ 1 - 2 مم²⁾باستخدام مشرط معقم.
5. نقل كل شيء (شظايا الأنسجة + المتوسطة) إلى أنبوب C التفكك الميكانيكية.
6. شطف طبق بيتري ومشرط مع 2 مل من المتوسطة باستخدام ماصة باستور وإضافة هذا إلى أنبوب C (حجم المتوسطة للتفكك = 3 مل).
7. استخدم برنامج التفكيك الميكانيكي A.01 لأنابيب C (البرنامج الأكثر لطفا) لتجانس شظايا الأنسجة في تعليق خلية واحدة. وضع أنبوب C في الجهاز وتشغيل البرنامج مرتين على التوالي (دورة واحدة = 25 ثانية).
   ملاحظة: وقد تم إنشاء هذا الإجراء التجانس والتحقق من صحة لأنسجة الثدي البشرية، وأنواع أخرى من الأورام أو الأنسجة قد تحتاج إلى استخدام برنامج مختلف، وينبغي اختبارها أولا.
8. إزالة أنبوب C من الجهاز وdecant المتجانسة مباشرة إلى مصفاة الخلية 40 ميكرومتر يجلس على أنبوب 50 مل. باستخدام ماصة باستور نفسها كما هو الحال في الخطوة 1.6، نقل أي سائل المتبقية في أنبوب C إلى مصفاة الخلية.
9. نقل السائل المصفى إلى أنبوب 15 مل باستخدام طرف ميكروبايت 1 مل. مؤقتا الحفاظ على مصفاة الخلية وأنبوب 50 مل.
10. شطف أنبوب C مع 3 مل إضافية من المتوسط ونقل هذا، مرة أخرى باستخدام ماصة باستور نفسه كما هو الحال في الخطوة 1.6،إلى مصفاة الخلية لا تزال جالسة على أنبوب 50 مل. ضغط كمية قصوى من السائل المتبقي المحاصرين في الأنسجة غيروجينية في أنبوب 50 مل عن طريق تحريك بلطف حول مصفاة مع ماصة باستور نظيفة أو 1 مل تلميح التي ألقيت في وقت لاحق بعيدا لتجنب تلويث eluate.
11. وضع مصفاة الخلية رأسا على عقب على أنبوب C الأصلي وشطف مع 3 مل من المتوسطة بحيث يسقط الأنسجة غير المتجانسة مرة أخرى في أنبوب C.
12. إعادة تجانس كما في الخطوة 1.7 لدورتين من برنامج A.01.
13. صب هذا المتجانس الثاني من خلال مصفاة الخلية يجلس على أنبوب 50 مل، شطف أنبوب C مرة أخرى مع 3 مل المتوسطة (كما هو الحال في الخطوة 1.10)ونقل مع ماصة باستور إلى مصفاة الخلية يجلس على أنبوب 50 مل مرة أخرى الضغط على كمية قصوى من السائل من النسيج الضام المتبقية المحاصرين في مصفاة الخلية.
14. عند هذه النقطة، وحجم ~ 2.5 مل في أنبوب 15 مل و ~ 9 مل في أنبوب 50 مل.

2. فصل الأنسجة العملاقة والخلايا

1. الطرد المركزي المتجانسات في أنابيب 15 مل و 50 مل لمدة 15 دقيقة في 600 × ز في درجة حرارة الغرفة.
2. Decant SN من أنبوب 15 مل في أنبوب نظيف وتخزينها مؤقتا في 4 درجة مئوية. يتم توضيح هذا الفائق = الورم الأساسي أو NANT أو الأنسجة الطبيعية SN (المجلد النهائي 2.5 مل) لاحقا وaliquoted قبل التخزين عند -80 درجة مئوية للتحليلات المستقبلية (انظر أدناه).
3. تجاهل supernatant من أنبوب 50 مل.
4. إعادة إنفاق بلطف كل الكريات الخلية في حجم النهائي من 1 مل المتوسطة. لفترة وجيزة، أولا كسر بلطف بيليه الخلية في كلا الأنبوبين (عن طريق النقر على أنبوب على سطح صلب). Resuspend بيليه الخلية فضفاضة في 50 مل مع 500 ميكرولتر من المتوسط ونقل تعليق هذه الخلية إلى أنبوب 15 مل لإعادة إنفاق بيليه الثاني. كرر هذه الخطوة مرة واحدة مع الثانية 500 ميكرولتر من المتوسطة لأقصى قدر من الانتعاش من الخلايا.
5. نقل 10 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى أنبوب صغير, مزيج مع 10 ميكرولتر من الأزرق تريبان (تخفيف 1:1) وعد عدد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس الدم.
   ملاحظة: عند هذه النقطة يمكن أيضا تحليل جزء صغير من تعليق الخلية عن طريق قياس التدفق الخلوي لتقييم حجم الخلية والحبيبة وإذا رغبت في ذلك عدد محدود من علامات السكان الفرعية لتقييم أكثر دقة لتوزيع الخلايا النسبية في التجانس قبل تحليل واسع النطاق أو التجريب. تتضمن جميع التحليلات حسب قياس التدفق الخلوي وضع العلامات CD45 لتطبيع الخلايا الفرعية.
6. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الخلايا من الورم, NANT, أو الأنسجة الطبيعية هي الآن جاهزة لمزيد من تنقية أو تحليل. هذه الخطوات الإضافية هي الأفضل عند تنفيذها في نفس يوم الجراحة.
   ملاحظة: لتحليل تدفق الخلايا ولكن ليس الخلية فرز خلايا الدم الحمراء المتبقية ينبغي أن يكون lysed بعد وضع العلامات على الأجسام المضادة عن طريق إضافة 0.4 مل من خلايا الدم الحمراء تحلل العازلة إلى بيليه الخلية، دوامة على الفور لمدة 1 ثانية واحتضان ما لا يقل عن 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (محمية من الضوء) قبل التحليل.

3. توضيح الأنسجة العملاقة

1. الطرد المركزي أنابيب 1.5 مل مع SN الأنسجة في 15،000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية.
2. إزالة بعناية supernatant دون لمس أو إزعاج بيليه. نقل إلى أنبوب نظيف (أو أنابيب) اعتمادا على عدد وحجم aliquots المطلوب.
3. تخزين supernatant في -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.

Representative Results

الشكل 1: مخطط تدفق البروتوكول. يتم عرض إجراءاتنا لمعالجة الأنسجة البشرية الطازجة وبعض النهج التحليلية التي يمكن استخدامها في وقت لاحق لتقييم الخلايا الليمفاوية التي تتسلل إلى الأنسجة البشرية.

الشكل 2: H & E صورة ملطخة بصمة أنسجة ورم الثدي. تظهر هذه البصمة، المأخوذة من جزء جديد من أنسجة ورم الثدي، وجود خلايا ورم مع المساحات المفتوحة التي تعكس المناطق التي لم يتم نقلها.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GentleMacs Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	BD Medimachine is somewhat equivalent
Centrifuge 5810 R	Eppendorf		or other standard table top centrifuge
Centrifuge 5417 R	Eppendorf		or other standard microcentrifuge
Esco Class II A2 Biosafety Cabinet	ESCO global		or other standard BSL2 hood
Inverted Microscope	Nikon eclipse TS100		or other microscope compatible for a hemacytometer
Bürker Chamber Marienfield		640210	or other standard hemacytometer
Navios Flow Cytometer	Beckman Coulter		or other flow cytometer (8-10 color recommended)
GentleMacs C-Tube	Miltenyi Biotec	130-096-344	BD Medimachine uses Filcon
Cell Culture Dish	Sarstedt	72,710	or other non-pyrogenic plasticware
Disposable Scalpel	Swann-Morton	510	or standard single use sterile scalpel
BD Cell Strainer 40 µm	Becton Dickinson	734-0002	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 50 ml	Becton Dickinson	352070	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 15 ml	Becton Dickinson	352097	or other non-pyrogenic plasticware
BD FACS Tube 5 ml	Becton Dickinson	352008	or other non-pyrogenic plasticware
Sterile Pasteur Pipette 5 ml	VWR	612-1685	or other non-pyrogenic plasticware
Microfuge Tube 1.5 ml	Eppendorf	7805-00	or other non-pyrogenic plasticware
X-Vivo 20	Lonza	BE04-448Q	serum-free medium recommended
Phosphate buffered saline	Lonza	BE17-516F	standard physiological PBS
Trypan blue	VWR	17942E	or other vital stain