Dissociazione Meccanica: Un metodo per ottenere cellule vitali da un tessuto

Overview

Questo video descrive la dissociazione non enzimatica del tessuto umano fresco per ottenere cellule vitali. La tecnica è utilizzata per l'analisi qualitativa e quantitativa di cellule positive CD45 (linfociti/leucociti) presenti in vari tessuti umani normali e maligni.

Protocol

1. Preparazione dell'omogeneato tissutale

1. I tessuti sezionati (tessuto maligno e normale reinsediato dalla sala operatoria) si trovano nel laboratorio di patologia da personale addestrato per il ritiro immediato. Il tumore, il NANT (preso la distanza più lontana possibile dal tumore) e i frammenti di tessuto normale vengono regolarmente elaborati entro 1 - 3 ore dall'escissione chirurgica in un laboratorio BSL2 utilizzando procedure standard di biosicurezza per i tessuti umani. Un diagramma di flusso del protocollo è illustrato nella figura 1.
2. Pesare tutti i frammenti di tessuto (normale, NANT e tumore) e misurare la lunghezza, la larghezza e l'altezza (lunghezza x larghezza x altezza). Questo è un passo importante per la successiva normalizzazione delle sottopopolazioni cellulari, dell'RNA estratto, ecc.
   NOTA: La gamma di dimensioni del campione è da 100 a 10.000 mm³ senza grasso, se possibile.
3. Imprimere il frammento tumorale su una diapositiva di vetro per la colorazione H&E per verificare che il tessuto sia effettivamente parte del tumore.
   1. Fallo premendo uno scivolo al microscopio di vetro sul frammento tumorale e applicando una leggera pressione con le dita per alcuni secondi.
   2. Fissare lo scivolo con isopropanolo per 2 minuti seguito da una fase di lavaggio in acqua. Controsostenere il tessuto per 30 secondi con l'ematossilina di Mayer.
   3. Lavare lo scivolo in sei bagni d'acqua. Macchia in phloxine B 2% per 15 sec.
   4. Lavare in un bagno d'acqua seguito da quattro bagni di isopropanolo e finire con un bagno d'acqua.
   5. Incubare in isopropanolo per 1 minuto e scolare. Sgombro in due bagni di xilene.
   6. Montare con supporto di montaggio a base di xilene. Esaminare la cellularità tumorale (Figura 2).
      NOTA: Principalmente, le cellule tumorali si attaccano allo scivolo impresso - le cellule stromali, linfoidi o adipose raramente rimangono, lasciando spazi tra le cellule tumorali (Figura 2).
4. Mettere il frammento di tessuto in un piccolo piatto di coltura contenente 1 ml del mezzo cellulare ematopoietico definito chimicamente e privo di siero (di seguito indicato come medio) a temperatura ambiente e dadi in piccoli pezzi (~1 - 2 mm²⁾usando un bisturi sterile.
5. Trasferire tutto (frammenti di tessuto + mezzo) in un tubo C dissociatore meccanico.
6. Risciacquare la piastra di Petri e il bisturi con 2 ml di mezzo utilizzando una pipetta Pasteur e aggiungerlo al tubo C (volume di mezzo per dissociazione = 3 ml).
7. Utilizzare il programma di dissociatore meccanico A.01 per tubi C (il programma più delicato) per omogeneizzare i frammenti di tessuto in una singola sospensione cellulare. Posizionare il tubo C nell'apparecchio ed eseguire il programma due volte in successione (un ciclo = 25 sec).
   NOTA: Questa procedura di omogeneizzazione è stata stabilita e convalidata per il tessuto mammario umano, altri tipi di tumore o tessuto potrebbero dover utilizzare un programma diverso e dovrebbero essere testati prima.
8. Rimuovere il tubo C dall'apparecchio e decantare l'omogeneato direttamente in un filtro a celle da 40 μm seduto su un tubo da 50 ml. Utilizzando la stessa pipetta Pasteur del passaggio 1.6, trasferire qualsiasi liquido rimanente nel tubo C al filtro cellulare.
9. Trasferire il liquido filtrato in un tubo da 15 ml utilizzando una punta in micropipetta da 1 ml. Mantenere temporaneamente il filtro cellulare e il suo tubo da 50 ml.
10. Risciacquare il tubo C con altri 3 ml di mezzo e trasferirlo, sempre utilizzando la stessa pipetta Pasteur del passaggio 1.6, al filtro cellulare ancora seduto sul tubo da 50 ml. Spremere una quantità massima del liquido residuo intrappolato nel tessuto disomogeneo nel tubo da 50 ml spostandolo delicatamente intorno al colino con una pipetta Pasteur pulita o una punta da 1 ml che viene successivamente gettata via per evitare di contaminare l'eluato.
11. Posizionare il filtro cellulare capovolto sul tubo C originale e risciacquare con 3 ml di mezzo in modo che il tessuto non disomogenizzato ri gocce nel tubo C.
12. Ri-omogeneizzare come nel passaggio 1.7 per due cicli del programma A.01.
13. Versare questo secondo omogeneo attraverso il filtro cellulare seduto sul tubo da 50 ml, sciacquare nuovamente il tubo C con un mezzo da 3 ml (come nel passaggio 1.10)e trasferire con la pipetta Pasteur al filtro cellulare seduto sul tubo da 50 ml spremendo nuovamente una quantità massima di liquido dal tessuto connettivo residuo intrappolato nel filtro cellulare.
14. A questo punto, un volume di ~ 2,5 ml è nel tubo da 15 ml e ~ 9 ml nel tubo da 50 ml.

2. Separazione del supernatante tissutale e delle cellule

1. Centrifugare gli omogeneati nei tubi da 15 ml e 50 ml per 15 min a 600 x g a temperatura ambiente.
2. Decantare l'SN dal tubo da 15 ml in un tubo pulito e conservare temporaneamente a 4 °C. Questo supernatante = tumore primario, NANT o SN del tessuto normale (volume finale 2,5 ml) viene successivamente chiarito e aliquoto prima della conservazione a -80 °C per analisi future (vedi sotto).
3. Scartare il supernatante dal tubo da 50 ml.
4. Rimorsi delicatamente entrambi i pellet cellulari in un volume finale di 1 ml di mezzo. In breve, rompere delicatamente il pellet di cella in entrambi i tubi (toccando il tubo su una superficie dura). Rimorsi il pellet a celle sciolte nei 50 ml con 500 μl di mezzo e trasferire questa sospensione cellulare nel tubo da 15 ml per rimorsi il secondo pellet. Ripetere questo passaggio una volta con il secondo 500 μl di mezzo per il massimo recupero delle cellule.
5. Trasferire 10 μl della sospensione cellulare in un piccolo tubo, mescolare con 10 μl di tripano blu (diluizione 1:1) e contare il numero di cellule vitali usando un emocitometro.
   NOTA: A questo punto una frazione della sospensione cellulare può anche essere analizzata dalla citometria del flusso per valutare la dimensione cellulare, la granularità e, se lo si desidera, un numero limitato di marcatori di sottopopolazione per una valutazione più precisa della distribuzione relativa delle cellule nell'omogeneato prima di un'analisi o sperimentazione approfondita. Tutte le analisi per citometria a flusso incorporano l'etichettatura CD45 per la normalizzazione delle sottopopolazioni.
6. Pellet le cellule per centrifugazione a 300 x g per 10 min a temperatura ambiente. Le cellule del tumore, del NANT o del tessuto normale sono ora pronte per un'ulteriore purificazione o analisi. Questi passaggi aggiuntivi sono i migliori se eseguiti lo stesso giorno dell'intervento chirurgico.
   NOTA: Per l'analisi citometrica del flusso, ma non per lo smistamento cellulare, i globuli rossi residui devono essere lisci dopo l'etichettatura degli anticorpi aggiungendo 0,4 ml di tampone di lisi dei globuli rossi al pellet cellulare, immediatamente vortice per 1 sec e incubando un minimo di 10 minuti a temperatura ambiente (protetto dalla luce) prima dell'analisi.

3. Chiarimento del supernatante tissutale

1. Centrifugare i tubi da 1,5 ml con SN tissutale a 15.000 x g per 15 min a 4 °C.
2. Rimuovere con cura il supernatante senza toccare o disturbare il pellet. Trasferire in un tubo pulito (o tubi) a seconda del numero e del volume delle aliquote desiderate.
3. Conservare il supernatante a -80 °C per un uso futuro.

Representative Results

Figura 1: Diagramma di flusso del protocollo. Vengono mostrati la nostra procedura per la lavorazione di tessuti umani freschi e alcuni approcci analitici che possono successivamente essere utilizzati per valutare i linfociti che si infiltrano nei tessuti umani.

Figura 2: Immagine macchiata H&E di un'impronta del tessuto tumorale del seno. Questa impronta, presa da un frammento di tessuto tumorale al seno fresco, mostra la presenza di cellule tumorali con gli spazi aperti che riflettono aree che non sono state trasferite.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GentleMacs Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	BD Medimachine is somewhat equivalent
Centrifuge 5810 R	Eppendorf		or other standard table top centrifuge
Centrifuge 5417 R	Eppendorf		or other standard microcentrifuge
Esco Class II A2 Biosafety Cabinet	ESCO global		or other standard BSL2 hood
Inverted Microscope	Nikon eclipse TS100		or other microscope compatible for a hemacytometer
Bürker Chamber Marienfield		640210	or other standard hemacytometer
Navios Flow Cytometer	Beckman Coulter		or other flow cytometer (8-10 color recommended)
GentleMacs C-Tube	Miltenyi Biotec	130-096-344	BD Medimachine uses Filcon
Cell Culture Dish	Sarstedt	72,710	or other non-pyrogenic plasticware
Disposable Scalpel	Swann-Morton	510	or standard single use sterile scalpel
BD Cell Strainer 40 µm	Becton Dickinson	734-0002	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 50 ml	Becton Dickinson	352070	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 15 ml	Becton Dickinson	352097	or other non-pyrogenic plasticware
BD FACS Tube 5 ml	Becton Dickinson	352008	or other non-pyrogenic plasticware
Sterile Pasteur Pipette 5 ml	VWR	612-1685	or other non-pyrogenic plasticware
Microfuge Tube 1.5 ml	Eppendorf	7805-00	or other non-pyrogenic plasticware
X-Vivo 20	Lonza	BE04-448Q	serum-free medium recommended
Phosphate buffered saline	Lonza	BE17-516F	standard physiological PBS
Trypan blue	VWR	17942E	or other vital stain