Overview
यह वीडियो व्यवहार्य कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए ताजा मानव ऊतक के गैर-एंजाइमैटिक वियोजन का वर्णन करता है। इस तकनीक का उपयोग विभिन्न सामान्य और घातक मानव ऊतकों में मौजूद सीडी 45 सकारात्मक कोशिकाओं (लिम्फोसाइट्स/ल्यूकोसाइट्स) के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए किया जाता है।
Protocol
1. ऊतक होमोजेनेट की तैयारी
- विच्छेदन पुनः प्राप्त ऊतकों (ऑपरेटिंग रूम से पुनः प्राप्त घातक और सामान्य ऊतक) तत्काल पिकअप के लिए प्रशिक्षित कर्मियों द्वारा पैथोलॉजी लैब में हैं। ट्यूमर, NANT (संभव के रूप में ट्यूमर से दूर दूर ले लिया) और सामान्य ऊतक टुकड़े नियमित रूप से मानव ऊतकों के लिए मानक जैवसेफ्टी प्रक्रियाओं का उपयोग कर एक BSL2 प्रयोगशाला में सर्जिकल उत्तेजना के 1 -3 घंटे के भीतर संसाधित कर रहे हैं। प्रोटोकॉल का प्रवाह चार्ट चित्र 1में दर्शाया गया है .
- सभी ऊतकों के टुकड़ों (सामान्य, NANT और ट्यूमर) का वजन करें और लंबाई, चौड़ाई और ऊंचाई (लंबाई एक्स चौड़ाई एक्स ऊंचाई) को मापें। यह सेल उपआबादी, निकाले गए आरएनए आदि के बाद सामान्यीकरण के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है।
नोट: नमूना आकार की सीमा 100 से 10,000मिमी 3 है जिसमें कोई वसा नहीं है यदि संभव हो तो। - एच एंड ई धुंधला के लिए एक गिलास स्लाइड पर ट्यूमर टुकड़ा छाप सत्यापित करने के लिए कि ऊतक वास्तव में ट्यूमर का हिस्सा है।
- ट्यूमर के टुकड़े पर ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड दबाकर और कुछ सेकंड के लिए अपनी उंगलियों के साथ कोमल दबाव लागू करके ऐसा करें।
- 2 मिनट के लिए आइसोप्रोपनॉल के साथ स्लाइड को ठीक करें और उसके बाद पानी में एक धोने का कदम है। मेयर के हेमेटॉक्सीलिन के साथ 30 सेकंड के लिए ऊतक को काउंटरटाइन करें।
- स्लाइड को पानी के छह स्नानों में धोएं। 15 सेकंड के लिए फ्लोक्सिन बी 2% में दाग।
- पानी के एक स्नान में धोएं इसके बाद आइसोप्रोपेनॉल के चार स्नान करें और पानी के एक स्नान के साथ समाप्त करें।
- आइसोप्रोपेनॉल में 1 मिनट और नाली के लिए इनक्यूबेट। जाइलीन के दो स्नान में स्पष्ट करें।
- जाइलीन आधारित बढ़ते माध्यम के साथ माउंट। ट्यूमर सेलुलरिटी(चित्रा 2) केलिए जांच करें ।
नोट: मुख्य रूप से, ट्यूमर कोशिकाएं अंकित स्लाइड से चिपक जाती हैं - स्ट्रोमल, लिम्फोइड या एडिपोस कोशिकाएं शायद ही कभी रहती हैं, जिससे ट्यूमर कोशिकाओं(चित्रा 2)के बीच रिक्त स्थान छोड़ दिया जाता है।
- ऊतक के टुकड़े को एक छोटी संस्कृति डिश में रखें जिसमें 1 मिलीलीटर रासायनिक रूप से परिभाषित, सीरम-मुक्त हेमेटोपोइटिक सेल माध्यम (इसके बाद मध्यम के रूप में संदर्भित) कमरे के तापमान पर और इसे बाँझ स्केलपेल का उपयोग करके छोटे टुकड़ों (~ 1 -2 मिमी 2)में पासा करें।
- सब कुछ (ऊतक टुकड़े + मध्यम) को एक यांत्रिक वियोजनक सी ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- एक पाश्चुर पिपेट का उपयोग करके 2 मिलीलीटर माध्यम के साथ पेट्री डिश और स्केलपेल कुल्लाएं और इसे सी ट्यूब (वियोजन के लिए माध्यम की मात्रा = 3 मिलीलीटर) में जोड़ें।
- एक एकल सेल निलंबन में ऊतक टुकड़े समरूप करने के लिए सी ट्यूब (सबसे कोमल कार्यक्रम) के लिए यांत्रिक वियोजन कार्यक्रम A.01 का उपयोग करें। उपकरण में सी ट्यूब रखें और उत्तराधिकार में दो बार कार्यक्रम चलाएं (एक चक्र = 25 सेकंड)।
नोट: इस समरूपता प्रक्रिया की स्थापना की गई है और मानव स्तन ऊतक के लिए मांय, अन्य ट्यूमर या ऊतक प्रकार के लिए एक अलग कार्यक्रम का उपयोग करने की आवश्यकता हो सकती है और पहले परीक्षण किया जाना चाहिए। - उपकरण से सी ट्यूब निकालें और एक 50 मिलीलीटर ट्यूब पर बैठे 40 माइक्रोन सेल छलनी में सीधे समरूप को डिकंट करें। चरण 1.6के रूप में एक ही पाश्चर पिपेट का उपयोग करना, सी ट्यूब में शेष किसी भी तरल को सेल छलनी में स्थानांतरित करें।
- फ़िल्टर किए गए तरल को 1 मिली माइक्रोपिपेट टिप का उपयोग करके 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। अस्थायी रूप से कोशिका छलनी और उसकी 50 मिलीलीटर ट्यूब रखें।
- सी ट्यूब को अतिरिक्त 3 मिलीलीटर मध्यम के साथ कुल्ला करें और इसे स्थानांतरित करें, फिर से चरण 1.6में एक ही पाश्चुर पिपेट का उपयोग करके, सेल छन्नी अभी भी 50 मिलीलीटर ट्यूब पर बैठे हैं। 50 मिलीलीटर ट्यूब में अहोमोजेनाइज्ड ऊतक में फंसे अवशिष्ट तरल की अधिकतम मात्रा को धीरे-धीरे एक साफ पाश्चुर पिपेट या 1 मिलीलीटर टिप के साथ छलनी के चारों ओर ले जाकर निचोड़ें जिसे बाद में एलुएट को दूषित करने से बचने के लिए फेंक दिया जाता है।
- कोशिका छलनी को मूल सी ट्यूब पर उल्टा रखें और 3 मिलीलीटर माध्यम से कुल्ला करें ताकि अहोमोजेनीकृत ऊतक सी ट्यूब में वापस गिर जाए।
- ए.01 कार्यक्रम के दो चक्रों के लिए चरण 1.7 में फिर से समरूप।
- 50 मिलीलीटर ट्यूब पर बैठे सेल छलनी के माध्यम से इस दूसरे समरूप डालो, सी ट्यूब को फिर से 3 मिलीलीटर माध्यम (चरण 1.10में) के साथ कुल्ला करें और पाश्चुर पिपेट के साथ 50 मिलीलीटर ट्यूब पर बैठे सेल छलनी में स्थानांतरित करें फिर से सेस छलनी में फंसे अवशिष्ट संयोजी ऊतक से अधिकतम मात्रा में तरल फैलाएंगे।
- इस बिंदु पर, ~ 2.5 मिलीलीटर की मात्रा 15 मिलीलीटर ट्यूब में और ~ 9 मिलीलीटर 50 मिलीलीटर ट्यूब में है।
2. ऊतक सुपरनैंट और कोशिकाओं का पृथक्करण
- कमरे के तापमान पर 600 x ग्राम पर 15 मिनट के लिए 15 मिलीलीटर और 50 मिलीलीटर ट्यूब में समरूपता को अपकेंद्रित्र करें।
- एसएन को 15 एमएल ट्यूब से एक साफ ट्यूब में डिसेंट करें और अस्थायी रूप से 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। इस सुपरनैंट = प्राथमिक ट्यूमर, NANT या सामान्य ऊतक एसएन (अंतिम मात्रा 2.5 मिलीलीटर) को बाद में स्पष्ट किया जाता है और भविष्य के विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से पहले अलीकोशित किया जाता है (नीचे देखें)।
- सुपरनेट को 50 एमएल ट्यूब से फेंक दें।
- धीरे-धीरे 1 मिलीलीटर माध्यम की अंतिम मात्रा में दोनों सेल छर्रों को फिर से पुनर्निर्भर करें। संक्षेप में, पहले धीरे से दोनों ट्यूबों में सेल गोली तोड़ (एक कठिन सतह पर ट्यूब दोहन से) । 50 मिलीलीटर मध्यम के साथ 50 मिलीलीटर में ढीले सेल पेलेट को फिर से रीसुस्ल करें और दूसरे पेलेट को फिर से रीसुस्ल करने के लिए इस सेल सस्पेंशन को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। कोशिकाओं की अधिकतम वसूली के लिए माध्यम के दूसरे 500 माइक्रोन के साथ एक बार इस कदम को दोहराएं।
- सेल सस्पेंशन के 10 माइक्रोन को एक छोटी ट्यूब में स्थानांतरित करें, ट्राइपैन ब्लू (कमजोर पड़ने 1:1) के 10 माइक्रोन के साथ मिलाएं और हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या गिनें।
नोट: इस बिंदु पर सेल निलंबन के एक अंश का विश्लेषण सेल आकार, दानेदारता का मूल्यांकन करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा भी किया जा सकता है और यदि व्यापक विश्लेषण या प्रयोग से पहले समरूप में सापेक्ष सेल वितरण के अधिक सटीक मूल्यांकन के लिए सीमित संख्या में उपजनसंख्या मार्कर वांछित है। प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा सभी विश्लेषणों में उप-जनसंख्या को सामान्य बनाने के लिए सीडी 45 लेबलिंग शामिल है। - कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को गोली मारें। ट्यूमर, NANT, या सामान्य ऊतक से कोशिकाओं को अब आगे शुद्धि या विश्लेषण के लिए तैयार हैं। सर्जरी के रूप में एक ही दिन में प्रदर्शन करते समय ये अतिरिक्त कदम सबसे अच्छे होते हैं।
नोट: प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए लेकिन अवशिष्ट लाल रक्त कोशिकाओं को छांटने वाली कोशिका को एंटीबॉडी लेबलिंग के बाद सेल पेलेट में 0.4 मिलीलीटर लाल रक्त कोशिका लाइसिस बफर जोड़कर, तुरंत 1 सेकंड के लिए भंवर और विश्लेषण से पहले कमरे के तापमान पर न्यूनतम 10 मिनट (प्रकाश से संरक्षित) को इनक्यूबेटिंग करके लाइसेस किया जाना चाहिए।
3. ऊतक सुपरनैंट का स्पष्टीकरण
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 15,000 x ग्राम पर ऊतक एसएन के साथ 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें।
- ध्यान से गोली को छूने या परेशान किए बिना अधिनाट को हटा दें। वांछित अलीकोट की संख्या और मात्रा के आधार पर एक साफ ट्यूब (या ट्यूब) पर स्थानांतरित करें।
- भविष्य के उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर सुपरनेट स्टोर करें।
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Representative Results
चित्रा 1: प्रोटोकॉल प्रवाह चार्ट। ताजा मानव ऊतकों और कुछ विश्लेषणात्मक दृष्टिकोणों को संसाधित करने की हमारी प्रक्रिया जो बाद में मानव ऊतकों में घुसपैठ करने वाले लिम्फोसाइट्स का आकलन करने के लिए उपयोग की जा सकती हैं।
चित्रा 2: एच एंड ई एक स्तन ट्यूमर ऊतक छाप की छवि दाग। यह छाप, एक ताजा स्तन ट्यूमर ऊतक टुकड़ा से लिया, खुले क्षेत्रों है कि स्थानांतरित नहीं किया गया परिलक्षित होता है रिक्त स्थान के साथ ट्यूमर कोशिकाओं की उपस्थिति से पता चलता है ।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GentleMacs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | BD Medimachine is somewhat equivalent |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | or other standard table top centrifuge | |
| Centrifuge 5417 R | Eppendorf | or other standard microcentrifuge | |
| Esco Class II A2 Biosafety Cabinet | ESCO global | or other standard BSL2 hood | |
| Inverted Microscope | Nikon eclipse TS100 | or other microscope compatible for a hemacytometer | |
| Bürker Chamber Marienfield | 640210 | or other standard hemacytometer | |
| Navios Flow Cytometer | Beckman Coulter | or other flow cytometer (8-10 color recommended) | |
| GentleMacs C-Tube | Miltenyi Biotec | 130-096-344 | BD Medimachine uses Filcon |
| Cell Culture Dish | Sarstedt | 72,710 | or other non-pyrogenic plasticware |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 510 | or standard single use sterile scalpel |
| BD Cell Strainer 40 µm | Becton Dickinson | 734-0002 | or other non-pyrogenic plasticware |
| BD Falcon Tube 50 ml | Becton Dickinson | 352070 | or other non-pyrogenic plasticware |
| BD Falcon Tube 15 ml | Becton Dickinson | 352097 | or other non-pyrogenic plasticware |
| BD FACS Tube 5 ml | Becton Dickinson | 352008 | or other non-pyrogenic plasticware |
| Sterile Pasteur Pipette 5 ml | VWR | 612-1685 | or other non-pyrogenic plasticware |
| Microfuge Tube 1.5 ml | Eppendorf | 7805-00 | or other non-pyrogenic plasticware |
| X-Vivo 20 | Lonza | BE04-448Q | serum-free medium recommended |
| Phosphate buffered saline | Lonza | BE17-516F | standard physiological PBS |
| Trypan blue | VWR | 17942E | or other vital stain |
