Summary
Burada, fare Kapkaççı lökosit homing çalışmada non-invaziv bir iki foton (2P) mikroskopi yaklaşımı açıklar. Biz, bizim doku görüntüleme hazırlık teknik yönlerini tartışmak ve yürütme ve veri toplama için kurulmuş ilk tipik bir deney yoluyla okuyucu yürümek.
Abstract
İki foton (2P) mikroskobu, yüksek çözünürlüklü bir görüntüleme tekniği geniş biyologlar tarafından adapte edilmiştir. 2P mikroskopi değeri dokulara içinde ve canlı farelerde hücre davranışları ile ilgili zengin Spatiotemporal bilgi sağlar. Lökosit işe host enfeksiyona karşı savunma ve ne zaman kontrolsüz önemli bir rol oynar, inflamatuar ve otoimmün hastalıklar için katkıda bulunabilir. Hücreler, ışık saçılması dokular içinde derin bulunan gemiler içinde hızla hareket ediyor bu yana, in vivo olarak lökosit işe incelenmesi teknik olarak çok zordur. Bugüne kadar, en intravital görüntüleme çalışmaları, kan damarları ve dokuların ortaya çıkarmak için cerrahi hazırlık gerektirir. Cerrahi kendisi tarafından indüklenen doku hasarı ve inflamasyon önlemek için, burada, biz fare Kapkaççı ve bilek lökosit ticaretini incelemek için kullanılabilecek bir tek hücreli non-invaziv görüntüleme yaklaşımı tanımlar. Biz, bizim 2P görüntüleme hazırlık teknik yönlerini tartışmak ve yürütme ve veri toplama için kurulmuş ilk tipik bir deney yoluyla okuyucu yürümek.
Protocol
1. Hayvan hazırlanması:
Bu protokol, nötrofil ve makrofajların floresan eGFP 1 ifadesi etiketli olan yetişkin dişi yetişkin LYSM eGFP fareler kullanır.
- Kan damarlarının Etiketleme:
(655nm) 100 ul PBS olmayan hedefli kuantum noktaları 15μl kan damarları, görselleştirmek için seyreltilir ve görüntüleme önce fare 10-30 dakika içinde intravenöz olarak enjekte edilir. - Anestezi:
- Veteriner inhalasyon anestezi sistemi (Noble Sağlık Hizmetleri A.Ş.) indüksiyon odasında fare yerleştirin.
- Buharlaştırıcı İsofluranın% 3-4 ve% 100 oksijen taşıyıcı gaz akış hızı ayarlayın ~ 1 L / dk. Arka ayak tutam refleks kaybı kadar yanlışlıkla anestezi doz aşımı önlemek için, hayvan yakından izlemek.
- Anestezi 1.5 muhafaza görüntüleme sırasında gerektiğinde solunum bozulmaları en aza indirmek için ayarlanmış ~ 2% İsofluranın ve ince. Farenin solunum hızı, anestezi yeterli bir düzlemde sigortalamak için görüntüleme oturum boyunca dikkatle izlenmelidir.
- Puralube veteriner merhem gözlerin kurumasını önlemek için uygulanır.
- Fare düzenlenmiş 36 yerleştirilir ° C ısıtma yastığı (Braintree Bilimsel) enjeksiyonları ve görüntüleme sırasında ve hipotermi önlemek için.
- Dehidratasyonu önlemek için, fare 100 ul PBS sc her 1-2 saatte bir verilir.
- Inflamatuar bir uyarana teslim lökosit işe ikna etmek için:
- Cerrahi evre ve% 70 etanol ile Kapkaççı çubukla fare yerleştirin.
- Insülin şırınga, iğne, enjeksiyon teslim derinliği hassas kolaylaştırmak ve geliştirmek için ~ 90 derece eğim yakın bir bükün.
- 1μl PBS içinde seyreltilmesi bioparticles E.coli 0.5 mg şırınga yükleyin. Bu kolay damlacık yük yapmak mikrofuge'de tüp kapağı yapılabilir.
- Kavisli bir forseps ile parmak tutun ve derinin hemen altına kadar eğim yukarı bakacak şekilde iğne ile deri yoluyla yavaşça yerleştirin.
- Yavaş yavaş enjekte edilir ve herhangi bir geri boşaltma önlemek için 5 saniye boyunca basılı tutun.
2. Görüntüleme sahne kurulumu:
Görüntüleme platformu merkezi üzerinden kesilerek yuvarlak bir delik olan bir alüminyum levha oluşur. Büyük bir kapak cam plaka ve lastik bir O-ring, arka pençe karşılamak için sıvı geçirmez bir gömme odasının oluşturmak için üstüne yapıştırılmış altına yapıştırılmış. 36 ° C plaka üstüne bağlanmış iki ısıtma elemanları ile alüminyum levha ısıtılır.
- Önceden ısıtılmış görüntüleme sahnede fare koyun ve 36 ° C ısıtıcı kullanarak farenin çekirdek vücut ısısını korumak.
- Superglue ince bir film tabakası ile görüntüleme odasının coverglass pençe sabitleyin.
- Tutkal iki defa herhangi bir kayan bit kaldırmak ve daha sonra odanın taze PBS (36 ° C önceden ısıtılmış) ile doldurmak için pençe yıkayın.
Fare hayvan canlılığı oluşturan 4 saate kadar görüntülenebilir. Ayak yavaşça küçük miktarda aseton ve uzunlamasına görüntüleme çalışmaları için yeniden canlandı fareler ile serbest bırakılabilir. Ancak, bu durumda, biz görüntüleme süresi <2 saat tavsiye ve anestezi doz aşımı ya da dehidratasyon riskini en aza indirmek için oturumlar arasında 24-48 saat bekliyor.
3. Imaging Acquisition
Bu protokolde kullanılan iki foton mikroskobu (2P mikroskop) dik bir mikroskop oluşan özel bir dahili video hızı dual lazer sistemi. Sistem iki Ti ile donatılmıştır: Sapphire lazerler, dört baş-3 ve 4 kanal aynı anda satın almalar ve 20x suya daldırma hedefi (Olympus, 20x/0.95 NA) Bi-alkali Proje Yönetim Ekipleri.
- 890-900nm safir lazer (Tutarlı A.Ş.): Chameleon XR Ti ayarlayın.
- , Mavi (<480 nm, ikinci harmonik üretimi sinyali), yeşil (480-560nm, LYSM eGFP pozitif nötrofil) ve kırmızı (> 560 nm, kuantum nokta etiketli kan damarlarının üç kanal ayrı 480nm ve 560nm dikroik aynalar (SemRoc) kullanın. .) Alternatif olarak, 560nm filtre E. ayırt etmek için bir 570nm filtre ile değiştirilebilir 655nm kuantum noktaları (kırmızı derin görünür) coli bioparticles (576nm bioparticles turuncu görünecektir).
- PBS içine dikkatlice amacı alt ve ayak bir gemi odaklanmak.
- Görüntü elde etme hızı, video-oranı (30f/sec) işletme ve kollajen doku işareti olarak, hızlı bir şekilde ilgi (tek bir kan damarı bulmak için (video oranının toplama hızı) doku anket kaynaklanan ikinci harmonik sinyali kullanılarak ile görünür LYSM eGFP nötrofiller).
- Proje Yönetim Ekipleri (renk ayrımı optimize etmek ve arka plan üzerinde yeterli sinyal elde etmek için gerekli lazer miktarını en aza indirmek için kazanç ayarlayın.dikkatli bir görüntü doyurmak için değil!).
- Çıkarlarının alan bölgede bulunan sonra, zaman atlamalı görüntüleme başlar. Time-lapse görüntüleme, iki farklı zamansal çözünürlükleri ile yapılabilir. , Görüntüleme hücre yuvarlanma ve yapışma için ve kan damarları içinde gerçek zamanlı olarak, tek bir z-düzlemi 30f/sec kazanmak. Parankim hücre ekstravazasyonu ve göç belgeleyen için 3B zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirin. Tipik bir satın alma protokolü, her Z-adım için ortalama 15 kare ve 30 saniye aralıklarla 200-225 50μm z adımları bir birim için 21 sıralı 2.5μm elde oluşacaktır.
- Sonra veri dosyaları laboratuar sunucu üzerinde saklanır, Imaris veya Volocity yazılımı 2 izleme çok boyutlu render ve hücre, 3 gerçekleştirmek için kullanılabilir.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Nötrofil hayal 1.Real-time (30f/sec) 200x damarlar boyunca yuvarlanan. Listeria monocytogenes ile enfeksiyon sonrası kırmızı renkte gösterilen 10mins hakkında damarların endotel boyunca zaman atlamalı görüntüleme haddeleme, yeşil, nötrofil gösterir. Bağ dokuda kollajen lifler mavi görünür. videoyu görmek için buraya tıklayınız.
200x nötrofil göçünü dinamikleri 2.Time hızlandırılmış 3D görüntüleme. Tipik nötrofil göçünü iltihaplı doku dolaşım ve göç gösterilmiştir. videoyu görmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu video protokol enflamasyona yanıt olarak, non-invaziv lökosit alımı 2P görüntüleme için prosedürler göstermektedir.
Kapkaççı gibi alerji, enfeksiyon ve otoimmün hastalığı 4-7 gibi inflamasyon çalışmaları klasik bir fizyolojik sitesidir. 2P görüntüleme, yuvarlanma ve kan damarlarında effektör fonksiyonu siteleri için kemotaksis yapışma, lökosit kaçakçılığı yollar farklı adımları ayrıntılı bir resim sağlar. Biz lökosit işe farklı tipte inflamatuar uyaranlara yanıt olarak değişir bulduk. Uyaranın dozu dikkatle seçilmiş ve fizyolojik bir hakaret özetlemek için her türlü girişim yapılmalıdır. Uyaran dozu çok yüksek ya da fizyolojik olmayan bir siteye teslim olursa, ev sahibi ya da kurşun deneysel eserler için korkutur ve anormal bir fenomen olabilir. Biz pilot deneyleri için uygun bir kontrol ile eşleştirilmiş ve teslim enjeksiyon hacmi ve derinliği hem hassasiyetini arttırmak için bükülmüş bir iğne kullanılarak uyaranlara titre edilen dozlar önerilir. Özellikle seri görüntüleme deneyleri için, aynı zamanda, enjeksiyon yerinde kolayca bulunan olabilir çok önemlidir. Bu, belirli bir yerde (yani, ikinci, üçüncü ayak üzerinde sağ arka pençe basamaklı) enjekte edilerek ya da cilt dövme ve Yakın enjekte yapılabilir.
2P görüntüleme lökosit kaçakçılığı ve in vivo effektör fonksiyonu görselleştirmek için eşsiz bir fırsat sunuyor. Intravital görüntüleme çoğunluğu anestezi fareler 8-10 doku ve kan damarları açığa çıkarmak için ameliyat gerektiren lökosit işe çalışma için kullanılan yaklaşımlar. Cerrahi kendisi lökosit davranışını etkileyecek enflamasyon neden olur. Ancak, 2P görüntüleme lökosit non-invaziv ve yerli 3D doku ortam içinde derin tek hücreli çözünürlükte incelenmesi gereken sağlar. Ayrıca, görüntüleme prosedürü bu yana kendisi fare zarar vermez, kanser ve artrit modelleri için uzunlamasına çalışmalar gerçekleştirmek için mükemmel bir seçimdir. 2P görüntüleme çözünürlük, tüm bireysel bir hayvan konu içinde sağlamak ve hastalığın başlangıcında ve ilerlemesinde bir hastalık süreci daha önce benzeri görülmemiş bir potansiyele sahiptir. Bu yaklaşım, hücresel bağışıklık ve enfeksiyona nasıl bu aynı tepkiler, yanlış düzenlenmiş, inflamatuar ve otoimmün hastalıklara yol açabilir altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaları içgörü elde etmek için değerli bir araçtır. Sonuç olarak, in vivo lökosit davranışı ayrıntılı bir resim enflamatuar ve enfeksiyöz hastalıkların tedavisi için yeni terapötikler gelişiminde yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
St Louis Washington Üniversitesi Hayvan Araştırmaları Komitesi tarafından onaylanan protokollere göre Tüm deneyler yapıldı.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH hibe R01-3.155-53.502 ve Washington Üniversitesi-Pfizer Biyomedikal Araştırma Anlaşması tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane, USP | Butler Animal Health Supply | 029405 | |
| 655nm non-targeted quantum dots | Invitrogen | Q21021MP | |
| Tetramathylrhodamine conjugated E. coli BioParticles | Invitrogen | E2862 | |
| Listeria monocytogenes (Lm) | Reference 2 | ||
| Quick gel | Duro | ||
| Puralube Vet Ointment | Pharmaderm Animal Health | ||
| Insulin syringes | BD Biosciences | 08290-3284-38 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30256.02 |
References
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
- Zinselmeyer, B. H., Lynch, J. N., Zhang, X., Aoshi, T., Miller, M. J. Video-rate two-photon imaging of mouse footpad - a promising model for studying leukocyte recruitment dynamics during inflammation. Inflamm Res. 57, 93-96 (2008).
- Zinselmeyer, B. H., Dempster, J., Wokosin, D. L., Cannon, J. J., Pless, R., Parker, I., Miller, M. J. Chapter 16. Two-photon microscopy and multidimensional analysis of cell dynamics. Methods Enzymol. 461, 349-378 (2009).
- Gray, D. F., Jennings, P. A.
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect Immun. 77, 5190-5201 (2009).
- Smith, C. J., Zhang, Y., Koboldt, C. M., Muhammad, J., Zweifel, B. S., Shaffer, A., Talley, J. J., Masferrer, J. L., Seibert, K., Isakson, P. C.
- Wipke, B. T., Allen, P. M. Essential role of neutrophils in the initiation and progression of a murine model of rheumatoid arthritis. J Immunol. 167, 1601-1608 (2001).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc Res. 5, 384-394 (1973).
- Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. in vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues. Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2604-2609 (2003).
