Summary
Dit protocol gaat in op de live-dissectie van de
Abstract
Het ophelderen van de mechanismen van axonaal transport heeft aangetoond dat het van groot belang zijn bij het bepalen hoe defecten in vervoer over lange afstand verschillende neurologische aandoeningen beïnvloeden. Defecten in deze essentiële proces kan nadelige gevolgen hebben op de neuronale werking en ontwikkeling. Hebben we een dissectie protocol dat is ontworpen om de bloot
Protocol
1. Voorbereiding van de reagentia
- Bereid de dissectie buffer voorbereiding door het toevoegen van de volgende verbindingen: 128 mM NaCl, 1 mM EGTA, 4 mM MgCl 2, 2 mM KCl, 5mM HEPES, en 36 mM sucrose in 1000 mL, PH op 7,2 en het filter te steriliseren.
2. Voorbereiding van de Dissection
- Siligard cube: De gel is teruggebracht tot ongeveer een cm breed, 1 cm lang en ongeveer 1 cm hoog. De gel kubus wordt geplaatst op een glasplaatje tijdens dissectie. Blokjes kan meer dan een keer worden gebruikt.
- Pins: Pins gebruikt worden voor dissectie moeten extra kort. De scherpe onderste gedeelte van minutien pinnen werkt het beste in dissectie.
- Nodig een scherpe microdissectie voorjaar schaar.
- Moeten twee mooie getipt tang.
3. Het verzamelen van Larven
- Wandering 3 e instar larven dat uiten van een GFP-gelabelde blaasje eiwit worden verzameld op een petrischaal.
- Larven worden gewassen in gedeïoniseerd water om zich te ontdoen van al het voedsel.
4. Live-dissectie van de larven
- Een larve is overgebracht naar de dissectie gel kubus op een glasplaatje. Larve is ondergedompeld in dissectie buffer.
- Larve is kwijnde op de voorste en achterste met twee fijne pinnen met de dorsale zijde naar boven.
- Met behulp van microdissection schaar, is een kleine snede gemaakt op de middenlijn de buurt van de achterste einde. Vanuit deze incisie een snede wordt gemaakt door tot de voorste. Met behulp van twee pinnen, pin de snede cuticula op de laterale randen.
- Voeg een druppel ontleden buffer. Verwijder voorzichtig de ingewanden, de darmen en vet lichamen met een pincet. De meeste van deze weefsels normaal gesproken buiten sijpelen in de dorsale snijden.
- Vervang de buffer met verse ontleden buffer. De larve mag nooit droog zijn en moet voortdurend in ontleden buffer.
- Incubaties met behulp van in vivo markers MitoTracker of LysoTracker worden gedaan op dit moment, door verdunning van de in vivo marker in dissectie buffer. Na de incubatie van de in vivo marker was de ontleed larve meerdere malen (5 quick wast) met behulp van verse ontleden buffer.
- Na het vervangen van de laatste wasbeurt duw de pinnen in de syligard en onmiddellijk dekglaasje aan. De larven is nu klaar voor observatie.
5. Live-beeldvorming van ontleed larven
- Plaats het dekglaasje en gel op de microscoop podium en beeld met behulp van een omgekeerde microscoop.
- We maken gebruik van een 100x objectief om de afbeelding getagd blaasjes binnen de larvale segmentale zenuwen. GFP expressie in de cel organen van de ventrale ganglion wordt eerst geëvalueerd voordat segmentale zenuwen zijn afgebeeld. Als robuuste GFP kleuring wordt waargenomen in de cellichamen in de ventrale ganglion, worden de zenuwen vervolgens belicht en gebruikt voor de evaluatie.
- Met behulp van een dual view systeem met filters voor CFP / YFP of RFP / YFP en split view software kunnen wij tegelijkertijd afbeelding twee gecodeerde eiwit in vivo.
6. Representatieve resultaten
Figuur 1:. Een representatief beeld toont veel axonale blaasjes op vele axonale tracks binnen een larvale segmentale zenuw Let op de klodders van GFP, wat neerkomt op axonale ophopingen.
Figuur 2: Een representatief beeld toont een axonale track met veel axonale blaasjes binnen een larvale segmentale zenuw.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vivo beeldvorming van synaptische vesicles vervoer in Drosophila larven segmentale zenuwen is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de mechanismen in het axonaal transport. We hebben eerder gebruikt dit protocol om het transport te evalueren dynamiek binnen de larvale zenuwen drukken uitgebreid polyQ herhalingen licht te werpen op hoe de uitbreiding van herhaalt de dynamiek van blaasje vervoer 3 beïnvloeden. Met behulp van dit protocol is de snelheid van het blaasje beweging kan worden bepaald door het omzetten van de video-streams op een kymograaf. Met behulp van genetica, kan GFP blaasje transport gevisualiseerd worden binnen een axon of binnen enkele axonen door gebruik te maken van een specifiek GAL4 driver om de expressie van GFP rijden. Bovendien de dynamiek van transport kan ook worden waargenomen in larven met mutaties voor specifieke genen. Nog twee blaasjes gelabeld met verschillende GFP-varianten (GVB of RFP) kan worden gelijktijdig gevisualiseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
SG wordt ondersteund door middelen van de State University van New York in Buffalo en van John R. Oishei Foundation.
MK werd ondersteund door een Student Research Award van CURCA bij UB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 Pair Micro Dissection Scissors | Fine Science Tools | Spring scissors – 6mm blade. 0.125 mm tip diameter | |
| 2 Pair Forceps | Fisher Scientific | Fisherbrand Dissecting Micro-Adson serrated tip forceps | |
| Box of Dissection Pins | Fine Science Tools | Minutien Pins 0.1mm diameter |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144, 1075-1085 (1996).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
