Summary
Этот протокол рассматривается жить рассечение
Abstract
Выяснения механизмов аксонального транспорта показано, что очень важно в определении того, как дефекты в переносе на большие расстояния влияют на различные неврологические заболевания. Дефекты в этой важнейшей процесс может иметь пагубные последствия для нейронов функционирования и развития. Мы разработали протокол вскрытия, который предназначен для предоставления
Protocol
1. Подготовка реагентов
- Подготовка подготовки рассечение буфер добавлением следующих соединений: 128 мМ NaCl, 1 мМ EGTA, 4 мМ MgCl 2, 2 мМ KCl, 5 мМ HEPES, и 36 мМ сахарозы в 1000 мл, рН до 7,2 и фильтр стерилизуют.
2. Подготовка к Dissection
- Siligard куба: гель сократить примерно на один дюйм шириной, 1 дюйма в длину и около 1 см высокие. Гель куб помещают на предметное стекло во время вскрытия. Кубы может быть использована более одного раза.
- Выводы: Выводы используются для вскрытия должны быть дополнительными короткими. Резкое часть нижней выводов minutien лучше всего работает в рассечение.
- Нужна одна острыми ножницами весной микродиссекции.
- Вам нужно два прекрасных наконечником щипцами.
3. Сборник Личинки
- Блуждающие 3-го возраста личинки, которые выражают GFP меткой пузырьков белка собираются на чашке Петри.
- Личинки промывают в деионизованной воде, чтобы избавиться от всех пищи.
4. Живая вскрытии личинок
- Личинка переходит к кубу рассечение гель на стекле. Личинка погружается в рассечение буфера.
- Личинка тосковал на передней и задней с помощью двух тонких булавок с спинной стороной вверх.
- Использование микродиссекции ножницы, небольшой надрез в средней линии у заднего конца. Из этого разреза надрез до передней. С помощью двух булавок, контактный вырезать кутикулу на боковых ребер.
- Добавить каплю рассекает буфера. Осторожно выньте кишки, кишечника и жира тела щипцами. Большинство из этих тканей обычно ила во время спинной резки.
- Замените буфер со свежими рассекает буфера. Личинка никогда не должны быть сухими и должны постоянно находиться в рассекает буфера.
- Инкубацию использованием в естественных условиях MitoTracker маркеров или LysoTracker сделаны в это время, путем разведения в естественных условиях маркер рассечение буфера. После инкубации в маркер естественных мыться расчлененный личинка несколько раз (5 быстрой мойки) с использованием свежих рассекает буфера.
- После замены последнего мыть толчок булавки в syligard и сразу же покровным. Личинки готов к наблюдению.
5. Живая съемка расчлененный личинки
- Место покровное и геля на столик микроскопа и изображения с помощью инвертированного микроскопа.
- Мы используем 100x линзы изображение меткой пузырьков внутри личиночной сегментарные нервы. GFP выражение в ячейке органов брюшной ганглий первую оценку до сегментарные нервы образ. Если надежные окрашивания GFP наблюдается в клеточных тел в брюшной ганглий, нервы то отображаемого и использоваться для оценки.
- Использование двойной системы представления с фильтрами для CFP / YFP или RFP / YFP и программного обеспечения с разделением мы можем одновременно два изображения меткой белка в естественных условиях.
6. Представитель Результаты
Рисунок 1:. Представитель изображение, показывающее многих аксонального пузырьки на многих аксонального треков в личиночной сегментарный нервный Примечание капли GFP, представляющих аксонального накоплений.
Рисунок 2: представитель изображение, показывающее один аксонального трек со многими аксонального пузырьков внутри личиночной сегментарный нерв.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В естественных изображений синаптических пузырьков в транспорте дрозофилы личиночной сегментарные нервы является мощным инструментом для изучения механизмов в аксонального транспорта. Ранее мы уже использовали этот протокол для оценки транспортной динамики внутри личиночной нервы выражения расширена polyQ повторений, чтобы выяснить, как расширение повторяет повлиять на динамику пузырька транспорта 3. Используя этот протокол скорость движения пузырьков может быть определена путем преобразования видеопотоков в кимографе. Использование генетики, GFP пузырьков транспорта могут быть визуализированы в пределах одного аксона или в течение нескольких аксонов с использованием специального GAL4 водителю ездить выражения GFP. Кроме того, динамика транспорта может также наблюдаться у личинок проведение мутаций конкретных генов. Далее две пузырьки с меткой различные варианты GFP (СФП или RFP) может быть одновременно визуализировать.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
SG поддерживается за счет средств из государственного университета Нью-Йорка в Буффало и от Джона Р. Oishei Foundation.
МК была поддержана премии научных студенческих работ по CURCA на УБ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 Pair Micro Dissection Scissors | Fine Science Tools | Spring scissors – 6mm blade. 0.125 mm tip diameter | |
| 2 Pair Forceps | Fisher Scientific | Fisherbrand Dissecting Micro-Adson serrated tip forceps | |
| Box of Dissection Pins | Fine Science Tools | Minutien Pins 0.1mm diameter |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144, 1075-1085 (1996).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
